2021-10-29

Cancer cell | 单细胞测序检测揭示CAR-T脱靶效应

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：31.743

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

嵌合抗原受体（CAR）工程细胞疗法，利用转基因免疫细胞产生定制的免疫反应，已经彻底改变了癌症治疗。近年来，CAR工程细胞疗法临床试验的数量、类型和适应症迅速增加。然而，严重且可能危及生命的毒性仍然是CAR工程细胞疗法的主要限制，如靶向、非肿瘤效应。本文通过分析来自人类蛋白质图谱和基因型组织表达项目的多个组织的大量表达数据，研究如何避免脱靶效应。

近期，在cancer cell杂志上发表了一篇名为“Expression of chimeric antigen receptor therapy targets detected by single-cell sequencing of normal cells may contribute to off-tumor toxicity”的文章，表明单细胞RNA测序（scRNA-seq）可能提供前所未有的高分辨率表达谱，使我们能够根据罕见细胞亚群中靶细胞的表达来了解CAR治疗的有效性和安全性。例如，正常脑组织中的一小部分壁细胞表达CD19，并被CD19CAR T细胞作为靶细胞，这可能通过增加脑血管通透性导致神经毒性。为了更好地理解CAR导向免疫治疗的效果，迫切需要对不同正常组织中不同细胞类型中不同CAR靶点的表达进行系统的单细胞水平解剖。

本文在两个独立的单细胞队列中分析了591个CAR靶点的表达，包括截至2021年1月的临床试验中使用的71个和预测具有良好安全性的520个，包括基于Microwell-seq的人类细胞景观（HCL）中的342755个成体细胞scRNA-seq数据以及基于103基因组学的成人细胞图谱（AHCA）中的84363个成人细胞scRNA序列数据。最近的一项研究发现，人脑中7906个细胞（0.15%）中只有12个CD19可测量的壁细胞可能会导致潜在毒性，因此本文使用了更严格的截止值，将CAR靶点定义为潜在危险基因（PRG）如果在100多个非免疫细胞和至少三个正常组织中超过2%的总细胞中可测量到。通过采用该标准，分别从HCL和AHCA中识别出92和88个PRG，并且HCL和AHCA数据集中共有57个PRG；这一结果表明本文的分析是可靠的。图1：研究抗CD19 CAR-T细胞试验中的严重神经事件。

本文分别鉴定了132个和147个PRG，其中100个为非免疫细胞，占总细胞的1%，100个为非免疫细胞，占总细胞的0.5%。所以考虑到灵活性，允许选择不同的截止值。值得注意的是，CD19和BCMA（也称为TNFRSF17）是经批准的CART细胞疗法用于治疗血液系统癌症的两个靶基因，在本文的单细胞分析和之前的大量表达数据分析中显示出相对有限的表达模式。鉴于scRNA-seq能够解剖罕见的细胞群和/或类型，能够识别出几个PRG，包括EGFR、PSCA和KDR（VEGFR2），它们在特定组织中高于阈值，而该组织尚未通过批量表达分析识别出相关组织。EGFR是在多个临床试验（例如NCT02331693和NCT03182816）中研究的CAR靶点，在包括胃在内的多个组织中表达（307个可测量细胞，占胃总细胞的2.2%，包括基质细胞、杯状细胞和胃主细胞），尽管EGFR在胃组织中的风险表达模式尚未通过大量分析确定。EGFR-CART细胞治疗的一期临床试验（NCT01869166）报告了EGFR阳性胆管癌和转移性胰腺癌患者的胃肠道不良事件，这与本文的单细胞分析结果一致。KDR是NCT01218867中研究的CAR靶点，由于在多个组织中的单细胞水平表达，包括肝脏（455个可测量细胞，占肝脏总细胞的4.3%），其通过大量数据分析确定为未检测到或低表达，因此存在潜在风险。图2：不同潜在危险基因（PRG）的组织和类型。

最近的研究开发了逻辑“和”开关，以实现更复杂的CARs结构，从而增加工程细胞的激活并将毒性降至最低。本文构建了一个由320884个风险较小的逻辑“和”设计基因对组成的预定义列表的单细胞级安全景观。将基因对定义为潜在风险对（PRPs）如果两个基因在100多个非免疫细胞中同时可测量，并且至少在一个组织中占细胞总数的2%以上。从HCL分析中确定了2972个PRPs，从AHCA分析中确定了8895个PRPs，两个数据集共享了1509个PRPs。其中，一些PRP至少包括一个PRG。EGFR-APP和EGFREC61G被鉴定为广泛表达在HCL和AHCA中的气管、甲状腺、胸膜、宫颈和动脉细胞中。大多数PRP不包含PRG，如APP-CD63，可在38183个细胞（占HCL总细胞的11.1%）中检测到，在HCL中扩展到28个组织中的22种不同细胞类型，在AHCA中扩展到20478个细胞（占AHCA总细胞的5.9%），在AHCA中扩展到11个组织中的14种不同细胞类型。图3：基于HCL分析，比较不同截止值确定的潜在危险基因（PRG）数量。

为了帮助研究界设计CAR目标，本文开发了一个友好的数据门户，单细胞水平的CAR靶基因毒性（CARTSC）（https://hanlab.tamhsc.edu/CARTSC/），以便在单细胞级别浏览和搜索单个目标以及逻辑“and”设计开关表达式。用户还可以检查免疫细胞和/或组织中所选基因的表达模式。

这项研究使用单细胞分析来报告潜在的目标，CAR靶向广泛组织的肿瘤外毒性景观。随着来自正常组织的额外的大规模人类单细胞组学数据变得可用，靶向的肿瘤外毒性概况的普遍性和准确性将可能显着增加。本文的研究并不建议停止基于PRG和/或PRP的临床试验。相反，本文建议事先考虑这些目标，以规避目标，肿瘤外毒性和密切监测，以获得早期毒性迹象。

本文的研究有几个局限性。缺乏大规模的单细胞蛋白质组学数据使无法根据单细胞分辨率下的蛋白质表达分析CAR靶标的潜在毒性。抗原表达密度是CAR细胞的重要考虑因素，在本研究中无法表征。此外，scRNAseq中的稀疏表达模式阻止分析激活剂-抑制剂基因对的潜在毒性，其中两种基因在一种组织中表达以降低毒性。肿瘤和正常组织中的全面单细胞多组学数据将为预测与CAR治疗相关的毒性提供额外的见解。今后将继续定期更新本文的数据门户网站，以包括最新的单细胞转录组，将来可以更深入地覆盖和/或丰富稀有细胞群。

教授介绍：

金颖

多能干细胞与发育生物学研究组

金颖，研究员，博士生导师。中国医学科学院/北京协和医科大学基础医学研究所病理生理学/药理学博士，美国北德克萨斯州大学健康科学中心Research Associate (1988-1994)，美国德克萨斯大学西南医学中心Research Fellow (1994-1998)。上海交通大学特聘教授，上海交通大学基础医学院特聘教授，中国科学院上海营养与健康研究所课题组长。上海曙光学者、中国科学院“百人计划”、第二届百名华侨华人专业人士杰出创业奖、上海市优秀学科带头人、上海市“三八”红旗手、上海市领军人才、上海交通大学优秀共产党员、中国科学院 “朱李月华优秀教师”和杰出研究员等荣誉获得者。主要研究方向为多能干细胞命运决定的分子调控。先后任J Biol Chem杂志编委，Stem Cell Research and Therapy杂志编委，《上海交通大学学报（医学版）》编委，《中华细胞与干细胞杂志》副主编，国际干细胞研究学会（ISSCR）会员、干细胞研究和临床转化指南更新任务组成员（2014年-2016年），上海市细胞生物学学会理事，中国细胞生物学学会细胞信号转导分会委员，中国细胞生物学学会干细胞生物学分会副会长等。在Cell Stem Cell、 Cell Res、Dev Cell、J Clin Invest和PNAS等学术期刊上发表通讯作者论文70余篇，先后获得教育部自然科学奖二等奖、上海市科学技术奖二等奖和三等奖，以及中国干细胞研究创新奖。

研究方向与进展：多年来集中研究多能干细胞，尤其是人胚胎干细胞，在体外增殖和分化的调控机制，致力于揭示维持胚胎干细胞无限自我更新的信号通路、转录因子和表观遗传调控因子等，旨在优化人胚胎干细胞的体外培养体系。同时，还关注人胚胎干细胞如何定向分化为神经细胞，尤其是如何形成神经系统不同区域的神经祖细胞，为获得临床疾病治疗需要的功能细胞奠定基础。

参考文献：

Ying Jing, Yuan Liu, Leng Han et al.Expression of chimeric antigen receptor therapy targetsdetected by single-cell sequencing of normal cells may contribute to off-tumortoxicity[J]. Cancer Cell 39, December 13, 2021.