骨组织免疫组化实验步骤（HRP-DAB法）

第一天

1. 拷片
石蜡切片37℃烤箱过夜（前一天放入烤箱，也可不做该步）。
脱蜡前于60℃烤箱烘烤2h。

拷片目的为使组织贴于玻片上，防止掉片。

2. 脱蜡与水化
依次将切片放入二甲苯I、II各10min。
乙醇梯度（100%、95%、80%、70%）各5min。
水洗5min。
TBS 3min×3，之后滤纸擦干组织周围，指甲油描边。

二甲苯、无水乙醇时间不可太长。
各试剂作用：二甲苯溶石蜡，无水乙醇洗脱二甲苯，梯度乙醇逐级脱水。

3. 抗原修复（二选一）
3.1 透明质酸酶+胃蛋白酶修复（推荐）
透明质酸酶 37℃ 30min，TBS 3min×3；
胃蛋白酶 37℃ 30min，TBS 3min×3。

透明质酸酶+胃蛋白酶酶工作液配制

• 透明质酸酶+去离子水（1.5-2.5mg/ml)
  调pH至4.5-6.0，-20℃保存。
• 胃蛋白酶+17%HCl (0.3%-0.5%)（w/v）
  调pH至1.0-2.5，-20℃保存。

3.2 胰酶修复
0.125%胰酶 37℃ 20min，室温冷却10min，TBS 3min×3。

胰酶工作液配制

• 0.5%胰酶储存液：胰酶50mg+ddH2O 10ml，-20℃保存；
• 1%CaCl2储存液：CaCl2 0.1g+蒸馏水10ml，4℃保存；
• 0.125%胰酶工作液：0.5%胰酶储存液2.5ml+1%1%CaCl2储存液1ml+蒸馏水6.5ml
  0.1M NaOH调pH至7.5-7.8。4℃可保存1月。

热修复骨组织切片掉片卷片严重，不可使用热修复修复骨组织。

4. 封闭
5%BSA封闭液 37℃ 30min，甩干不洗。
5. 孵育一抗
TBS或PBS稀释一抗。4℃湿盒过夜。

• 首次使用某抗体需自行摸索最佳抗体稀释比例。可根据说明书按照最小、中间、最大稀释度染3张片子，然后根据显色时间及颜色深浅调整稀释度。
• 4℃过夜为最适于抗原抗体反应的条件。
• 应保证过夜时间内切片不干。切片置于湿盒中，滴加适量液体（太少会干，太多漫过指甲油流出也会干）。

第二天

6. 孵育二抗
TBS 5min×5。
3%H₂O₂滴加于切片上，室温避光10min。
滴加聚合HRP标记二抗，37℃，30min。
TBS 5min×5。
7. DAB显色
依照DAB显色试剂盒说明书配制DAB显色液，

避光保存，现配现用，戴手套（DAB致癌）。

显微镜下观察控制显色时间，蒸馏水终止。

• DAB试剂致癌，使用过程中注意皮肤防护。凡接触DAB溶液物品及时丢弃。
• 显色一次不得超过5张，熟练者可自行调节。
• 显色时间应为10min以内，DAB在日光下会自行变为棕黄色。

8. 复染
苏木素复染（镜下观察控制）。
饱和磷酸一氢钠溶液返蓝。
9. 封片
脱水：70%、80%、95%、100%乙醇各3min。
透明：二甲苯I、II各5min。
中性树胶封片（从一侧封片，且封片时勿将二甲苯去除，片子放其中一个个封片）。

• 中性树胶为水不溶溶液，先将切片水分去除，脱水不彻底会造成切片模糊。
• 二甲苯：中性树胶溶剂为二甲苯，二甲苯可让中性树胶透明性更好；二甲苯遮光系数更趋近于显微镜物镜，可利于观察成像。
• 盖玻片：应用75%乙醇擦净后使用。

注意事项：

• 脱水前所有步骤切勿使切片风干，否则会造成非特异性染色。
• TBS清洗优于PBS清洗。抗原抗体反应前清洗一律TBS 3min×3，反应后TBS 5min×5。
• 热修复卷片严重，透明质酸酶+胃蛋白酶修复效果较好。