WB的内参有曝光而目的基因条带却空白——个人经验荟萃！

2019年2月17日，星期日，小雨
今天天气特别冷，我非但没有像昨天那样睡个懒觉，反倒早早就行了。
因为我还有最后的一些实验要收尾一下，然后告别实验室两个月左右。有些伤感，回首两个月来在实验室成长的点点滴滴，有过辛勤的汗水，有过失败的苦恼，有过成功的喜悦……
当我刚掌握了一些实验技能的时候就要无情离开，真的有点不舍，毕竟等我在此归来的时候，这些技能都可能还回去了。
不管怎么样，这只是暂别，刚好可以把前期的数据做一下梳理，然后更好的设计、筹划后续实验。
到了实验室，把最后一波免疫组化后续部分完成。把昨天洗脱的WB继续完成（这个洗脱液效果还可以。但结果没有多大的改善。有一个新的发现，就是曝光时间。这次我按照说明书的图例介绍，将曝光时间调到600秒，居然爆出来了。）

针对昨天的问题——WB内参有跑出来，目的基因条带却空白，今天做个解答。
1、一抗、二抗是不是搞混了？
答：结合两次实验结果，表明我没有把一抗二抗的种属搞混了。
2、胶切错了，使得目的条带遗漏？
答：切胶也没有问题，就是内参条带切的有点问题，抗体说明书的分子量是36KD，实际分子量是39KD。
3、组织蛋白表达量太少了？
答：这个可能性最大，目前我的WB蛋白量是30ug，进一步可以考虑用到50ug左右。
4、因为目的蛋白是催化酶，会不会提蛋白时没使用相关蛋白酶抑制剂（如cokertail等），导致蛋白丢失？
答：PMSF这个蛋白酶抑制剂效果还可以，将来有条件可以考虑联合其他蛋白酶抑制剂。
5、蛋白（两周前提的）放置时间太久了以致于蛋白降解了？
答：可能也有这个因素，导致蛋白用量下降，推荐提完蛋白尽快完成。
6、转膜时间（300mA，2h）太长了，导致蛋白穿过膜？
答：有两个目的蛋白。今天一个蛋白（64KD）被我曝出来了，另一个蛋白（52KD）始终是空白。高度怀疑转膜导致蛋白丢失。参考了别人的建议可以按下面方式设置转膜条件：200mA，1分钟/1KD。
7、电泳液时间太久了（我太懒了，用了别人的电泳液——十天前，跑过一次）？
答：实践表明影响不是特别大，可能影响蛋白在膜上的均质性。
8、曝光时间太短了？
答：对于表达量非常低的蛋白，建议把曝光时间延长。比如今天我把曝光时间设置500秒，在300秒的时候才看到条带，尽管很微弱，但也找到了结果，这给问题排除带来很大帮助。

补充两个问题：
9、是不是抗体的浓度问题，可能是太低了，可以提高一下？
答：对于52KD的蛋白，我提高了一倍的浓度，还是一样没有曝光出来。所以对于WB白片，这个浓度影响力应该排在比较靠后的位置。
10、曝光液的敏感性问题？
答：这个是比较关键的因素之一。在第二次跑胶，在蛋白含量不变的情况下，我控制了转膜时间，＜90分钟，配制了新鲜的抗体，同时使用了特超敏的ECL曝光液（第一次只是用了加强型ECL曝光液），这次效果就特别好。所以我建议使用特超敏型曝光液。

是时候Say goodbye了， 但我相信这不是forever!