10X单细胞空间联合分析解析的人类胚胎limb cell图谱

五一已过，不知道大家五一玩的怎么样，当然了，我也出去转了转，放一张图片，童年还是好啊~~~~

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生活还要继续，我们要继续往前走，今天我们来看看单细胞空间联合分析的另外一篇文献A human embryonic limb cell atlas resolved in space and time，作为公司的人，其实做了很多的分析项目，但是科研老师一般不愿意写公司人员的名字，非科研单位对文献还是有很多的负面影响，所以说，读博后悔三年，不读博后悔一辈子。

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Abstract

人的肢体在受孕后第四周以间mesenchymal buds的形式出现，在随后的几个月中发育成完全形成的肢体。肢体发育由许多时间和空间限制的基因表达程序协调，使表型的先天性改变很常见。几十年的模式生物工作概述了脊椎动物肢体发育的基本过程，但尚未对人类这一过程进行深入表征。在这里，使用单细胞和空间转录组学详细介绍了人类胚胎肢体在空间和时间上的发育。分析展示了细胞的广泛多样化，从有限数量的多能祖细胞发展到无数成熟细胞状态，并确定了几个新的细胞群，包括神经周围成纤维细胞和多种不同的间充质状态。分析发现了人类肌肉发育的两波浪潮，每一波都以不同的细胞状态为特征，由不同的基因表达程序调节。将肌肉蛋白 (MSC) 确定为维持肌肉干细胞特性的关键转录抑制因子，并通过在人胚胎成肌细胞中进行 MSC 敲低来验证这一点，这会导致晚期成肌基因的显著上调。在一系列孕龄范围内对肢体细胞类型进行空间映射表明与短指和多指相关的基因之间存在明显的解剖学分离，并揭示了进展区的两个转录和空间不同的群体，我们称之为“外部”和“过渡”层。后者表现出与软骨细胞谱系相似的转录组学特征，但缺乏关键的软骨形成转录因子 SOX5,6 和 9。最后，对小鼠胚胎肢体进行 scRNA-seq，以促进单细胞分辨率下的跨物种发育比较, 发现两个物种之间的实质同源性。

Introduction

人体limb buds在受孕后第 4 周（PCW4）结束时出现，并在孕早期发育形成手臂和腿。通过研究小鼠和小鸡等模式生物，我们知道limb buds的发育以两种主要成分的形式开始。多能顶叶侧板中胚层 (LPM) 细胞凝聚到骨骼系统中，骨骼肌祖 (SkMP) 细胞从中胚层旁迁移到肢体区域，形成肌肉。这些多能祖细胞被包裹在一层外胚层中，其中的一个subset（称为顶端外胚层脊/AER）控制间充质细胞增殖并通过成纤维细胞生长因子 (FGF) 信号传导帮助建立肢体轴。随着limb buds的伸长，这些 AER 信号不再扩散到最近的间充质细胞并开始分化。在人类头三个月的剩余时间里，四肢继续以近端-远端的方式成熟，因此到 PCW8 时，茎足类、zeugopod 和 autopod 的解剖结构已经牢固确立。这种成熟受到时间和空间限制的基因表达程序的复杂系统的严格控制。与任何复杂系统一样，即使是单个程序中的小扰动也可能导致肢体结构和功能的深刻变化。事实上，大约每 500 人中就有 1 人出生时患有先天性肢体畸形

尽管模式生物提供了有关可转化为人类发育和疾病的细胞命运和形态发生的关键见解，但目前尚不清楚这些模型如何准确地概括人类发展。 此外，在此类研究中缺乏互补的空间信息，妨碍了综合组织catalogue 的assemble，该catalogue提供了人类肢体在空间和时间上的发展的全局视图。 值得注意的是，人类发育细胞图谱最近将单细胞和空间转录组学等细胞图谱技术应用于几种组织，为发育和疾病提供了新的见解。 因此，将这些技术应用于人类胚胎和胎儿组织对于进一步了解人类肢体的发育具有很大的前景。

在这项研究中，进行了基于液滴的单细胞转录组测序 (scRNA-seq) 和空间转录组测序，以重建妊娠早期发育过程中人类后肢的综合图谱。 然后，对小鼠胚胎肢体进行了 scRNA-seq，以便在这种分辨率水平下比较跨物种的肢体发育过程。 研究结果以高分辨率和基因组广度详细描述了人体肢体在空间和时间上的发育，从 114,000 个捕获的单细胞中识别出 55 种细胞类型，并在四个时间点进行空间映射，以揭示肢体成熟的动态过程 . 此外，空间转录组学数据可以深入了解新生和成熟肢体中的关键模式和形态发生途径，重点是与肢体畸形相关的基因。

Results

Cellular heterogeneity of the developing limb in space and time

为了跟踪发育中肢体中不同谱系的贡献，分析收集了从 PCW5 到 PCW9 的单细胞胚胎肢体轮廓。 这个时间窗口涵盖了肢体芽形成的早期阶段以及肢体成熟的后期阶段。 总共分析了 114,047 个通过质量控制过滤器的单细胞。 通过回归去除细胞周期表达模块并进行批量校正后，确定了 55 种细胞类型和状态。

这些细胞状态中的 32 个源自 LPM 的细胞。 它们包含参与软骨、骨骼和其他结缔组织成熟的间充质、软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞状态，这与先前对肢体细胞构成的研究一致。 除了这些 LPM 衍生的细胞外，另外八种状态形成了完整的肌肉细胞谱系，它们作为 PAX3+ 祖细胞从体细胞迁移。 这些继续在肢体中分化形成肌祖细胞和肌管

其他非 LPM 细胞状态包括四种原始和定形红细胞、两种类型的骨髓细胞、三种类型的血管内皮细胞和三种类型的神经嵴衍生细胞。 最后，确定了三种上皮细胞状态，其中是肢芽远端边缘的 AER 细胞，它们表达 SP8 和 WNT6。 检查不同胎龄中每种细胞状态的相对丰度揭示了发育中肢体的细胞景观如何随时间变化。 在上述每个谱系中，出现了一种清晰的模式，即祖状态主要从 PCW5 和 6 中分离出来，此后出现更多分化的细胞状态。

为了进一步剖析具有空间背景的细胞异质性，并以模型生物中建立的肢体模式原理为基础，对来自 PCW5 和 PCW8 的肢体样本进行了空间转录组学实验。使用 10X Genomics Visium 芯片，能够生成转录组图谱，每个spot平均捕获 1,000 到 5,000 个基因。然后，应用 cell2location 将细胞状态标签从单细胞图谱转移到去卷积 Visium spot。在每个时间点产生的 Visium 载玻片的细胞组成图将组织切片划分为不同的组织学区域。有趣的是，在 PCW5.6 样本中，观察到清晰的祖细胞类型区域分离，将进展区分为两层，将其命名为“外部”和“过渡”进展区。外部进展区细胞 (PZC) 位于肢芽的远端外围。包裹在其中的是过渡 PZC 以及发育中的自足动物的表达 SOX9 的成软骨细胞。这种新颖的空间差异伴随着细微的转录组差异，外部进展区特异性地表达了一些与数字模式有关的基因，包括 LHX2 和 TFAP2B。后者的突变导致 Char 综合征，其特征是轴后多指畸形。过渡进展区特异性地表达 IRX1，这是一个数字形成中的关键基因，它建立了软骨组织和非软骨组织之间的界限。通过在外部和过渡 PZC 之间进行差异表达测试，能够表征定义每个群体的基因模块。然后，计算了其他主要谱系中每个模块的表达评分，揭示了过渡 PZC 模块在软骨细胞谱系中上调，在任何其他谱系中没有其他任何模块的明显上调。这表明这些细胞可能是未分化进展区细胞和定型成软骨细胞之间的过渡状态。事实上，定义过渡进展区的基因在很大程度上与骨骼系统发育有关。

In addition to the PZC, prehypertrophic chondrocytes (PHC) expressing India Hedgehog (IHH) localised to the mid-diaphysis of the forming tibia and the metatarsals.在样本的近端极限处，观察到表达 MEIS2 的近端间充质细胞 (PrMes) 和 CITED-1+ 间充质细胞 (Mes2)，与肢体发育的早期阶段一致。

作者还开发了一个图片对齐的方法，用来观察同一结构不同时间段的变化。分析发现，具有相关（但不相同）转录组谱的细胞状态不一定占据相同的位置，能够根据 Visium 和 scRNAseq 数据的 cell2location 反卷积分析对其进行量化。这表明在成纤维细胞谱系中，三个簇与表达 KRT15 的基底细胞和表达 SFN 的周皮细胞位于同一位置，表明在真皮谱系中的作用并促使它们被注释为真皮成纤维细胞 (DermFiB) 及其前体。 另一个表达 ADH1B (ADH+FiB) 的成纤维细胞簇与肌肉细胞共定位，在真皮区域没有发现等效的population。

总体而言，这些发现为了解包括肌肉、肌腱、骨骼和基质谱系在内的细胞隔间内的细微转录组差异提供了新的见解。 这种综合分析是一个例子，说明空间转录组学方法如何提高我们对组织结构的理解，并在整个肢体等解剖结构的发育动力学背景下定位细胞状态本身。

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Patterning, morphogenesis and developmental disorders in the limb

空间图谱为稳态条件下的基因表达提供了有价值的参考，用于与胚胎发育过程中表型可能开始渗透的遗传变异进行比较。

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Regulation of cell fate decisions of mesenchymal-derived lineages

inferred cell-fate trajectories in the 32 mesenchyme-associated states by combining diffusion maps, partition-based graph abstraction (PAGA) and force-directed graph (FDG)。使用 SCENIC 包将其与转录因子 (TF) 网络推断相结合，以识别与每个谱系的进展相关的活动 TF 网络的不同模块。

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Regulation of embryonic and fetal myogenesis

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Spatially resolved microenvironments exhibit distinct patterns of cell-cell communication

为了研究细胞类型之间的通讯，利用 CellphoneDB python 包来识别发育中肢体中细胞类型的阶段特异性配体-受体相互作用。 然后对该输出进行过滤，以揭示组织学水平上位于同一位置的细胞群之间的信号通路，使用 cell2location 因子分析以无偏见的方式确定。

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关注一下方法：

轨迹分析

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空间通讯

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