Single-Cell Characterization of Malignant Phenotypes and Developmental Trajectories of Adrenal Neuroblastoma
文章亮点：
正常发育的神经嵴相关细胞决定了成神经细胞瘤（neuroblastoma，NB）的特征
NB具有明显的肾上腺髓质细胞（chromaffin-cell，CHCs）表型
肾上腺髓质细胞的分化状态能够高度预测患者预后
MYCN 扩增与上皮间充质转化 (epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) 增强的躯干神经嵴细胞（neural crest cell, NCCs）表型密切相关
背景：
NB是NCCs起源的恶性肿瘤的一个亚型，是儿童中最常见的颅外实体肿瘤，尽管有广泛的研究，NB潜在的发展起源仍不明确。
已有报道儿童恶性肿瘤可能是由胚胎期或出生后早期发育的前体细胞引起, NB被认为起源于背主动脉的主干神经嵴细胞(NCCs)，也称为交感肾上腺祖细胞。NCCs也被认为是交感神经元和神经内分泌(NE)肾上腺髓质细胞的前体细胞，NB肿瘤细胞具有未分化的NCC-like表型,因此NB的肿瘤发生可能发生在NCC向交感神经元和NE分化之前。
本文章以肾上腺NB（占所有NB的47%）为研究对象，通过使用单细胞转录分析将NB肿瘤细胞的表型与其假定的发育来源联系起来。
样本：
早期人类胚胎（样本数：2，测序细胞数：36,839）
胎儿肾上腺（样本数：4，测序细胞数：49,209）
NB肿瘤（样本数：16，测序细胞数：160,910, 样本疾病类型：14 NB，2 GNB （ganglioneuroblastoma））
Public bulk RNA data: 106个TARGET NB样本；498个NB队列样本（GSE49710）
结果：
早期胚胎中神经谱系发育的异质性
根据目前已有认知，NCC前体来源于背神经管（dorsal neural tube，NT）的背侧部分，并经历上皮-间充质转变(EMT)的过程，接着从NT分离，在整个胚胎发育中进行迁移。作者对4 post-conceptional weeks(PCW)的胚胎进行单细胞测序，得到10个主要的单细胞聚类分群，其中2，3，5，6 被认为是NCC相关的细胞谱系，重新聚类，得到14个亚群。对NCC祖细胞进行RNA velocity 细胞谱系分析。结果证明了EMT的进程在NCC的脱离和迁移过程是必须的。pre-EMT NCCs 仍然表达 NT-specific 转录因子, 在EMT NCCs中这些转录因子表达明显下调。很多NCCs 的特定表达gene，在EMT状态中低表达，这一发现表明，EMT NCCs 还没有完全发育为NCCs，更像是一个NCCs 分离时的一个瞬时状态。
胎儿肾上腺的交感肾上腺谱系在发育中的异质性
3个胎儿肾上腺的交感肾上腺谱系（Schwann cell precursors，SCPs; Sympathoblasts; CHCs）被分离出来重新分群，重分群在两个分化细胞中显示出明显的细胞周期特征。通过cell trajectory分析（Palantir） 观察到SCPs在分化为CHCs前，先分化为Cycling CHCs 前体细胞，与前期报道相符。通过评估SCP向两个分支分化的概率，发现SCP更倾向于分化为CHCs。
原发性NB肿瘤中的单细胞图谱
NB肿瘤中的单细胞可以分显著分为以上7群，通过单细胞数据的染色体拷贝数变异推测，NE细胞表现出更多的变异。这表明NE细胞在各个肿瘤样本中表现为恶性细胞。
恶性细胞特征与早期细胞发育的关系
作者应用non-negative matrix factorization (NMF) 方法探究瘤内转录表达异质性，最终分为9个主要的肿瘤meta-prgram。将恶性meta-program与前面单细胞分析中描述的NB起源细胞的特征进行了比较，一些恶性meta-program具有与CHCs和成交感细胞最相似的分子特征，这表明肿瘤细胞可能在表型上更接近于CHCs或成交感细胞。利用k-nearest neighbors algorithm预测肿瘤细胞在单细胞分辨率下的特征。发现所有肿瘤，无论组织学亚型或分化状态如何，主要由CHCs-like肿瘤细胞组成. 通过MuSiC拆分106个Target 样本中的bulk RNA数据，结合临床信息，发现样本可以被分为3群，group A 表现出SCP-like的特征（主要是根据GNB/NB 分型不同），group B 表现出EMT NCCs的特征，主要与MYCN的扩增相关。与单细胞数据一致，大部分样本被归类为group C 表现出CHCs-like的特征。
CHCs的分化状态与NB的临床异质性有关
前面发现NB表现出显著的CHC特征，在正常发育和生长过程中，CHC可以分为分化后的CHC（differentiated CHC，DCHC）和未分化的CHC（undifferented CHC, UCHC), 作者在498个NB样本中进一步进行分群分析，发现样本可以显著分为3群。并且这3群与临床特征密切相关，并且在肿瘤患者的预后表现中呈现明显的差异。说明NB的异质性可以表现为两种状态的chromaffin细胞表型相似性的变化。
NB中转录因子的调控网络
细胞表型是由核心调控TFs决定的，TFs与顺式调控元件相互作用以指导转录程序。接下来，作者应用单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)分析来确定共同表达的TFs和它们假定的作为TF调控活性的靶基因。几乎所有的肿瘤都显著上调了CHC相关的调节因子，三个MYCN扩增的肿瘤样本并没有显著激活EMT NCC相关的调节因子。单细胞发现MYCN过表达和TWIST1上调之间存在关联。近期研究发现TWIST1和MYCN在NB肿瘤细胞中通过占据相似的增强子，协同驱动致癌增强子驱动转录。
作者接下来检查了与CHCs分化状态相关的调节因子，并确定它们是否与NB肿瘤细胞共享。DCHCs高度上调了在去甲肾上腺素谱系分化中起重要作用的转录因子，下调了细胞周期相关的转录因子。高分化的肿瘤细胞显示出DHCH相关调节因子的活性增强，进一步表明CHC的分化状态与肿瘤异质性相关。在大多数非MYCN扩增的肿瘤中，没有发现未分化循环状态和MYCN表达以及调节活性之间的强相关性，即MYCN表达水平对肿瘤细胞的增殖分化状态没有显著影响。综合起来，SCENIC分析显示，肿瘤内的增殖和分化状态是由一个类似的与CHCs发展相关的转录调控网络构建的。
CHC细胞的动态分化反映瘤内恶性细胞的状态
鉴定CHCs的特征基因是否能够特异性地指示肿瘤细胞的分化状态。作者搜索了分化的CHC细胞和meta-program 3（与CHC表型最相似）的特征基因之间的重叠基因，筛选出5个基因(NTRK1, PRPH, NPY, PCP4, PKIB) 最符合在分化的CHC中高表达的标准。这些基因表达斗鱼cell-cycle负相关。RNA velocity 比较细胞未来状态在两种不同状态之间的概率分布，预测每个肿瘤中都有相当大比例的正向DHCH细胞的循环肿瘤细胞。提示NB瘤内肿瘤细胞异质性主要与CHCs分化的细胞状态相关。这可以提高对NB发生的肿瘤消退行为的认识。
结论：
通过使用scRNA-seq和转录相似性的详细分析，我们发现NB实际上呈现了一个纯CHC-like表型。这种表型显示了与早期未分化的NCC-like细胞相关的转录不同亚群的有限复杂性。总之,我们预计,我们的数据作为一种资源对未来解码细胞内的分子机制，自发NB回归,以及所需的关键细胞相互作用，维持细胞在发育和疾病下的状态十分有益。
生信工具总结：
去除doublet：Scrublet
降维/聚类/可视化：Seurat
批次校正：Harmony
推测CNV分析：inferCNV
kNN analysis： FNN in R
转录因子分析：SCENIC
伪时间序列分析：Palantir
RNA velocities: velocyto in R
Deconcolution analysis: MuSiC
Survival analysis: survival in R