觉得甲基化太普通？来看看cfDNA甲基化！

A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer

基于cfDNA甲基化的新型模型可提高结直肠癌的早期发现率

发表期刊：Mol Oncol

发表日期：2021 Mar 11

影响因子：6.574

DOI:  10.1002/1878-0261.12942

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一、研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤。尽管治疗方法有所改善，但TNM期晚期CRC患者的预后仍较差。IV期CRC患者的5年生存率为14%，而I期CRC患者的5年生存率为91%。因此，早期CRC的筛查是降低CRC相关死亡率的重要策略之一。

DNA甲基化是细胞用来调控基因表达的表观遗传机制之一。已发现肿瘤抑制基因的低甲基化是许多癌症的早期事件。

循环肿瘤DNA（ctDNA）由细胞外核酸片段组成，通过肿瘤细胞的坏死、凋亡或活性DNA分泌释放到血液中。据报道，在一些肿瘤中，尤其是晚期癌症患者中，无细胞DNA（cfDNA）的数量高于健康人。

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二、材料与方法

 1 数据来源

1）肿瘤组织及相应的癌旁正常组织来源于结直肠癌切除患者。从离原发肿瘤5cm以上的正常小肠采集邻近的正常组织。

2）晚期腺瘤组织标本取自中山大学附属第六医院FFPE标本。

3）从健康对照组或未接受治疗的患者中抽取10毫升血液。

 2 分析流程

DNA甲基化水平计算：在5个CpG的滑动窗口内至少有3个甲基化CpG的读数被指定为共甲基化读数（PCM），用于随后的甲基化模式分析和患者样本恶性/正常状态的预测建模。采用log2pcm进行建模，优化了模型的性能和稳定性。

具体流程：

流程图

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三、结果展示

01 - cfDNA浓度的测量 

CRC和AA样本的cfDNA浓度明显高于健康对照样本（图2）。CRC和AA患者产生的平均cfDNA浓度分别为每1ml血浆6.43 ng +/- 0.45和6.08 ng +/- 0.65，而健康对照组的平均浓度为每1ml血浆3.94 ng +/- 0.24。总体而言，CRC和AA患者的cfDNA浓度高于健康对照组。

图2 健康对照组、NAA、AA和CRC患者的cfDNA提取分析

02 - 确定CRC特有的甲基化生物标志物的特征

采用Wilcoxon秩检验和BHP-adjust法对组织队列的测序数据进行分析后，确定了667个CRC特异性DNA甲基化生物标志物，以区分CRC和AA与正常组织样本（图3A）。这667个生物标志物的相关分析结果如图S1所示。这些生物标志物经常分布在基因组的内含子（28.34%）和启动子（25.19%）区域。正常队列中的甲基化水平与AA和CRC队列中的甲基化水平有显著差异（图3B）。此外，AA组的DNA甲基化生物标志物的水平，通过除以正常组的PCM和Log2转化计算，与恶性组相似，这表明DNA甲基化可能是CRC的早期表观遗传事件（图3C）。

图3 组织DNA甲基化景观的特征分析

图S1 667个CRC特异性DNA甲基化生物标志物的相关性分析

03 - cfDNA甲基化模型在CRC检测中的发展和验证

在组织队列中发现667个CRC特异性DNA甲基化生物标志物后，进一步分析了这667个生物标志物在血浆队列中的甲基化情况。在性别、年龄、TNM阶段匹配后，将133份正常和248份CRC血浆样本随机分组，分别纳入训练队列和验证队列。应用最小绝对收缩和选择操作者（LASSO）法收缩训练队列中CRC特异性DNA甲基化生物标志物的数量。最终得到11个与年龄无关的甲基化生物标志物（图S2）。

图S2 年龄与11个CRC特异性DNA甲基化生物标志物的相关性分析

然后利用逻辑回归构建这11个生物标志物的cfDNA甲基化模型。在训练队列中，Youden指数定义的风险评分阈值为0.58，cfDNA甲基化模型在训练队列中检测CRC的灵敏度为82.4%，特异性为84.8%，在验证队列中的灵敏度和特异性分别为84.6%和86.6%。该模型在训练（AUC = 0.90）和验证队列（AUC = 0.92）中都能将CRC患者与健康对照组区分开来（图4A-B）。

然后，评估了该模型在分离NAA、AA和I期CRC患者与健康对照中的表现，发现AUC分别为0.77、0.85和0.90（图4D-F）。此外，根据11个DNA甲基化生物标志物计算出的风险评分，证明NAA、AA和CRC患者的风险评分明显高于健康对照组（图4I）。这些数据表明，cfDNA甲基化模型可以作为CRC检测的稳健和非侵入性方法。

图4 无细胞DNA甲基化模型在检测腺瘤和CRC患者中的性能和风险评分

04 - cfDNA甲基化模型与传统肿瘤生物标志物在CRC检测中的临床应用比较

目前，癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是CRC治疗监测中最常用的血液肿瘤生物标志物之一。此外，CEA和CA19-9的异常增高也会导致临床上对CRC的怀疑。本研究比较了cfDNA甲基化模型与CEA和CA19-9监测在CRC检测中的表现。

结果显示，cfDNA甲基化模型在CRC检测中的灵敏度和特异性均优于CEA和CA19-9（AUC 0.91对0.77和0.59，图5）。此外，相对于CEA和CA19-9监测，cfDNA甲基化模型与晚期腺瘤和肿瘤分期有很好的相关性，显示了cfDNA甲基化模型在CRC早期检测中比CEA和CA19-9的优势。

图5 cfDNA甲基化模型与肿瘤生物标志物CEA和CA19-9的CRC诊断性能比较

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四、结论

综上所述，作者建立了一个有前景的、非侵入性的cfDNA甲基化模型，用于检测CRC，尤其是早期CRC和晚期腺瘤。该模型的诊断价值在一个独立的队列中得到了验证，凸显了其在CRC早期检测中的应用前景。