Cell Res | 大规模多组学分析发现垂体瘤组织亚型与靶点
原创 huacishu 图灵基因 2022-11-11 10:18 发表于江苏
收录于合集#前沿生物大数据分析
撰文：huacishu
IF=46.297
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亮点：
1、作者对200名PitNET患者进行了迄今为止最大规模的综合基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析；
2、作者基于蛋白质组学的PitNETs分类确定了7个簇，进一步分析确定了不同簇的潜在治疗靶点；
3、作者在750名PitNET患者的独立队列中，进一步证实了这些确定的分子标记物和不同簇/亚型的变化。
复旦大学赵曜（Yao Zhao）教授课题组在国际知名期刊Cell Res在线发表题为“Integrated proteogenomic characterization across major histological types of pituitary neuroendocrine tumors”的论文。垂体神经内分泌肿瘤（PitNET）是最常见的颅内肿瘤之一。作者对200名PitNET患者进行了迄今为止最大规模的综合基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析。基因组学数据表明，GNAS拷贝数增加可以作为PIT1谱系过度增殖的可靠诊断标志。基于蛋白质组学的PitNETs分类确定了7个簇，其中，过度表达上皮-间充质转换（EMT）标记物的肿瘤簇为更具侵袭性的亚组。
进一步分析确定了不同簇的潜在治疗靶点，包括CDK6、TWIST1、EGFR和VEGFR2。为探索免疫治疗在PitNET中的应用潜力而进行的免疫分型确定了JAK1-STAT1-PDL1轴的变化与免疫衰竭之间的关系，以及JAK3-STAT6-FOS/JUN轴的变化和免疫浸润之间的关系。在750名PitNET患者的独立队列中，进一步证实了这些确定的分子标记物和不同簇/亚型的变化。这种跨越传统组织学界限的蛋白质基因组分析改善了对PitNET病理生理学的理解，并提出了新的治疗目标和策略。
垂体神经内分泌肿瘤（PitNET，也称为垂体腺瘤）是最常见的颅内肿瘤之一。目前仅使用三种TF（PIT1、TPIT和SF1）来描述主要的PitNET细胞谱系，尽管患者表现出不同的激素分泌情况和不同的临床预后，这表明，其他TF可能参与肿瘤的发生。虽然大多数已发表的研究都是基因组或转录组学分析，但综合多组学分析可以为不同PitNET谱系确定稳健的发病机制、预后和治疗标志物提供必要的全面视角。
整合多组学策略的进展，结合基因组分析，推动了几种不同肿瘤类型的治疗。为此，作者分析了来自200个PitNET和7个垂体前叶（APG）作为对照的基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据集。对PitNET亚型建立了一种新的、分子上无偏见的分类，以了解其病理生理机制，并探索每种亚型的潜在作用靶点。此外，为这些分析生成的数据将成为PitNET进一步生物学和功能研究以及药物发现的重要资源。
PitNET标本的蛋白质组学分析
为了获得PitNET的蛋白质基因组图谱，根据病理标准，从200个新鲜冷冻肿瘤和7个APG作为对照收集了全外显子组测序（WES）、转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据集。临床病理学特征包括TF谱系、临床病理亚型、手术侵袭状态、患者性别、肿瘤直径和KNOSP分级。图1a说明了三种TF谱系和空细胞腺瘤（Null）的样本分布，它们进一步分为10种临床病理亚型：PIT1谱系（GH、PRL、 TSH、silent PIT1和20多种激素）、TPIT谱系（ ACTH和 silent TPIT）、SF1（GN和 silent SF1）和NULL。
对200个肿瘤组织和配对的外周血单核细胞（PBMC）进行了WES，以确定癌症基因组中可能的遗传变异。对194例肿瘤和7例APG进行了RNA测序（RNA-seq）。使用基于质谱（MS）的无标记定量（LFQ）方法来表征200个肿瘤和7个APG的蛋白质组。基于Fe-NTA富集的策略用于194个肿瘤和7个APG的磷酸蛋白组学分析（图1a）。
PitNET蛋白质基因组景观概述
WES数据分析揭示了7333个突变基因，包括11092个非沉默点突变和419个小插入或缺失（图1b）。在200名患者中，观察到几个与PitNET功能相关的显著突变基因（SMG），包括GNAS（11%）、KRT76（8%）、TCH（6%）、ZMIZ2（6%），DGKZ（6%）和KRTAP9-2（5%），以及USP8（4%）（图1b）。对体细胞碱基变化比例的检查表明，与其他五种替代类型相比，PitNET患者的C>A转换比例较高（图1b）。
与之前使用癌症基因组图谱（TCGA）进行的研究比较表明，在这项研究中，PitNET队列中的肿瘤突变负担（TMB）在33种癌症类型中仍处于中等偏下水平（图1c）。
接下来，比较了SMG的变异等位基因频率（VAF），发现USP8突变排名第一，其次是GNAS突变（图1d）。与临床病理亚型相关的突变的富集分析表明，USP8突变在ACTH亚型中富集，而GNAS突变在多激素亚型和GH亚型中富集（图1e）。体细胞CNA分析确定了臂水平扩增（Chr 5、7、8、9、12q、14q、19、20、21p）和缺失（Chr 1p、2q、11）（图1f）。焦点峰包括5p15.33、7p14.1、12p13.2、13q12.12、14q11.2和16p13.13的扩增以及1q21.3、11q11、17q24.3和22q11.23的缺失等（图1g）。
多组学数据的主成分分析（PCA）显示，PIT1谱系（GH、PRL、TSH、沉默PIT1和多激素亚型）与APG、ACTH、沉默TPIT和其他PitNET在蛋白质组学水平上存在显著分离，而PIT1谱系在转录组学和磷酸蛋白组学水平与APG组具有更高的相似性（图1h）。
基因组改变对转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组的影响
配对转录组学和蛋白质组学数据集的相关分析表明，6115对mRNA-蛋白质对中有92.95%在肿瘤样品中呈正相关。与神经元系统、上皮间充质转化（EMT）和激素代谢过程相关的几个途径中富含具有强相关性的基因，这表明这些途径在PitNETs中过度表达（图2a）。
作者研究了23109个体细胞拷贝数更改（CNA）对基因组中相同基因座（顺式效应）和其他基因座（反式效应）基因的mRNA、蛋白质和磷酸蛋白丰度的调节作用（图2b）。作者观察到6545和684个CNA的顺式效应分别影响mRNA和蛋白质。其中，502个显著的顺式效应事件重叠（图2c）；这502个基因富含与翻译后蛋白质修饰、NAD+生物合成和代谢相关的途径（图2d）。
然后，评估了CNA事件如何通过顺式或反式效应影响癌症相关基因（CAG）的mRNA、蛋白和磷酸蛋白丰度。结果发现，CNA对15个CAG的mRNA和蛋白质丰度都具有顺式效应，而6个CAG在mRNA和磷酸蛋白水平上显示出显著重叠的CNA顺式效应（图2e）。图2f显示了这21个CAG的注释。
PIT1谱系中GNAS突变和GNAS拷贝数增加的影响
在作者的队列中，富含PIT1谱系的GNAS是最常见的突变基因，具有两个突变热点，即R186C/G/L/H和Q212L（图1b、3a）。GNAS拷贝数增益，作为具有顺式效应的CAG（图2f），对PIT1谱系有特别强烈的影响（图3b）。具有GNAS突变或GNAS拷贝数增加的样品在PIT1谱系中显著富集（图3c）。
因此，通过整合WES数据，可以进一步将PIT1谱系分为三个亚组，包括野生型（WT）、GNAS拷贝数增益和GNAS突变体。与WT组相比，携带GNAS突变的样品显示GNAS蛋白水平降低，而那些GNAS拷贝数增加的样品在mRNA和蛋白水平上显示GNAS增加（图3d）。
PitNET患者的GNAS突变与G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路的功能增强有关。与WT组相比，参与生长激素（GH）合成、分泌和作用途径（如GH1和GH2）的基因在GNAS突变体组的mRNA、蛋白质和磷酸化水平上调（图3e，f）。
PitNET报道了20q扩增，而20q扩增和GNAS CNA（位于20q）的顺式和反式效应仍不清楚。通过对转录组学/蛋白质组学数据集进行的基因集富集分析（GSEA）表明，在GNAS拷贝数增加的患者中，增殖相关途径（如细胞周期和DNA复制途径）上调（图3h）。此外，与WT组相比，GNAS拷贝数增加组具有更高的多基因增殖评分（MGPS）和临床肿瘤体积（图3i）。
为了确定GNAS拷贝数增益驱动的PIT1谱系的增殖特性，作者系统地表征了与细胞周期和DNA合成相关的信号级联。在细胞周期相关分子中，PRKDC和CDK6是与GNAS拷贝数正相关的前两种蛋白质（图3j）。此外，数据表明E2F和CDK2被下调，这可能导致ORC家族成员的上调。GNAS拷贝数增加患者中ORC家族、RFC家族和PCNA的上调可能导致DNA生物合成增加和肿瘤细胞增殖增强（图3j）。
为了进一步证实GNAS拷贝数增加的影响，对GNAS和CDK6进行了免疫组织化学（IHC），并计算了IHC染色评分（H评分）。在PIT1谱系PitNETs和所有PitNET中，GNAS高-H评分组中CDK6高-H评分细胞的比例大于GNAS低-H评分组（图3k，l）。
总之，这些发现说明了GNAS基因中基因组事件的不同影响，此外，GNAS拷贝数增加可显著增强肿瘤细胞增殖的发现表明，靶向CDK6的抑制剂治疗可能对具有GNAS拷贝量增加的PIT1谱系患者有效。
PitNETs的多组学分类
为了全面探索该队列中的表型和基因型PitNET多样性，使用联合的转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据进行共识聚类分类。该分析确定了PitNET中的七个蛋白质组、五个转录组和七个磷酸蛋白质组簇，随后根据它们与临床病理亚型的相似性和主要的通路关联进行命名。
在蛋白质水平上，七个蛋白质组簇包括GHenrich、EMTPRO、PRLenrich、TSH/沉默PIT1enrich和ACTHenrich，沉默TPITenrich以及SF1/NULLenrich（图4a）。途径富集分析表明，Hedgehog信号通路在GHenrich中差异上调，MYC靶点v1在PRLenrich中上调（图4a）。TSH和沉默的PIT1共同聚集并富集了干扰素应答、抗原处理和呈递等途径。
此外，男性更常见（78.3%），平均年龄更高（>60，39.1%），肿瘤直径更大(≥40 mm、23.9%）（图4b）。值得注意的是，TPIT谱系在蛋白质水平上分为两个较小的簇，ACTHenrich和沉默的TPITenrich，这与临床病理亚型一致。ACTHenrich簇富含USP8突变，ACTHenrich和沉默的TPITenrich的女性比例极高（分别为90.5%和90.9%）（图4b）。
为了进一步表征PitNETs的蛋白质基因组分类，对PitNET的十个临床病理亚型、三个TF谱系和NULL、五个转录组簇、七个蛋白质组簇和七个磷酸蛋白质组簇进行了综合分析。使用蛋白质组学数据鉴定的ACTHenrich、沉默的TPITenrich和SF1/NULLenrich簇与使用转录组学和磷酸蛋白组学数据识别的簇高度一致（图4c）。此外，在转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学水平上，还鉴定了一组具有明显EMT特征的PitNETs。
在PIT1谱系中发现了以EMT为特征的侵袭性簇
鉴于EMT在癌症转移中的不可忽视的作用，接下来使用ESTIMATE算法，基于转录组学数据和蛋白质组学数据，对肿瘤中基质细胞的贡献进行反褶积。EMTPRO在基质评分_RNA和基质评分_Protein中显示出总体较高的基质评分（图4d）。并确认EMTPRO簇在所有蛋白质组簇中具有基质表型的细胞比例最高（图4e）。EMTPRO簇中panCK和FN1共染色的区域百分比明显高于其他簇（图4f）。所有这些证据支持EMTPRO簇的特征是具有EMT状态的肿瘤细胞。
作者比较了PIT1谱系中两个转录组簇之间的TF mRNA表达水平（图4g），这证实了五个EMT TF在EMTRNA中显著上调，包括：SNAI1、ZEB2、TWIST1和TWIST2。由于激素分泌蛋白上调，剩余的PIT1系簇被称为激素。此外，五种EMT TF的mRNA表达模式在EMTRNA和EMTPRO簇中均显著正相关（图4h）。
值得注意的是，与激素簇相比，EMTRNA簇中五种EMT TF的转录活性水平更高（图4i）。类似地，EMT相关分子，包括CDH2、VIM、CD44、FN1和ITGB1（间充质标志物）在EMTRNA簇中上调，而CDH1、KRT8和KRT18（上皮标志物）则在转录组学和蛋白质组学数据集中下调（图4i），进一步证实了该簇的EMT状态。
此外，队列中TWIST1和ZEB2的IHC染色证实EMT TF在EMTRNA中被激活。TWIST1和ZEB2的H评分与其相应的肿瘤体积之间存在显著的正相关，TWIST2和ZEB的高H评分与PIT1谱系中的手术侵袭相关（图4j）。总之，PitNETs的综合蛋白质基因组特征鉴定了一个以前未被识别的高度侵袭性集群，该集群由PitNET中的EMT定义，主要包含PIT1谱系肿瘤（图4k）。
PitNETs免疫浸润的特征
接下来，使用转录组学数据的xCell分析进行细胞类型反褶积，以推断肿瘤微环境中不同细胞类型的比例（图5a）。基于推断的细胞比例的共识聚类确定了四组具有不同免疫和基质特征的肿瘤：免疫衰竭、CD4+T细胞浸润、内皮和CD8+T细胞渗透（图5a）。
包含ACTHenrich和沉默的TPITenrich簇的CD8+T细胞浸润簇的特征在于存在多种免疫细胞类型，包括中央记忆CD8+T细胞和CD8+TD细胞（图5a）。此外，CD8+T细胞浸润簇显示EGFR信号和细胞周期途径上调（图5a，b）。内皮簇的特征是抗原呈递细胞，在mRNA水平上调CSF1R、CD34和PDL2，在蛋白水平上调FGFR1（图5a，b）。
在CD4+T细胞浸润簇中，免疫抑制介质CTLA4被上调，表明这些肿瘤可能对免疫检查点相关的治疗方案有反应（图5a，b）。免疫耗尽簇由TSH/沉默PIT1enrich和GHenrich蛋白质组簇组成，主要分布在PIT1谱系中，其特征是基于转录组学数据的Treg细胞得分较高和PDL1（CD274）上调（图5a）。
事实上，PDL1 mRNA表达在TSH/沉默的PIT1enrich和GHenrich蛋白组簇中显著上调（图5c），以及在TSH、沉默的PIT1和GH临床病理亚型中显著上调。鉴于其在免疫抑制中的作用，作者进一步探讨了PDL1 mRNA表达与JAK1-STAT1-PDL1相关分子之间的相关性，包括PITNET中的IFNGR1、EIF4E、JAK1和STAT1（图5d）。正如预期的那样，这些分子在mRNA、蛋白质和磷酸蛋白水平上显著正相关。
在PitNET队列中，通过IHC染色对PDL1的进一步验证表明，PDL1在一些临床病理亚型中的表达水平高于其他亚型，包括TSH、沉默PIT1和GH。在TSH/沉默PIT1enrich和GHenrich簇（蛋白质组亚型）和免疫耗尽簇（免疫亚型）中，PDL1 H评分显著更高，这与从多组学数据中获得的结果一致（图5e）。
在PIT1谱系中，发现PDL1在TSH/沉默PIT1enrich和GHenrich簇中上调，这与它们较低的免疫评分一致。相比之下，PIT1谱系中的其他簇，如EMTPRO簇，具有较高的免疫评分和较低的PDL1表达。另一个JAK-STAT轴JAK3-STAT6-FOS/JUN的表达与免疫评分高度相关（图5f）。此外，FOS和JUN TF调节下游趋化因子，如CCL2、CCL5、IL6和TGFB1，所有这些都在mRNA和蛋白质水平上与免疫评分显著正相关（图5f，g）。在多组学数据中，在PIT1谱系肿瘤和所有PITNET中，JAK1/STAT1与JAK3/STAT6呈中度负相关（图5h）。
总之，这些数据显示了PIT1谱系中的双向调节，包括TSH/沉默PIT1enrich和GHenrich簇中可能对检查点（PDL1和PD1）抑制剂有反应的免疫抑制机制，以及EMTPRO簇中可能被免疫疗法靶向的免疫浸润机制（图5i）。
750名PitNET患者独立队列中标志物的验证
研究确定了七个肿瘤簇，每个蛋白质组簇的代表性分子特征总结在图6a中。为了评估本研究中观察到的结果是否比初始队列更稳健，在750个PitNETs的独立队列中验证了这一发现。高肿瘤直径组的GNAS高H-评分比例明显高于低肿瘤直径组，高GNAS H-评分表明预后差（图6b，c）。这些结果与200名PitNET患者的初始队列中获得的结果一致。对200个PitNET队列中确定的EMT TF的检查（图4j）表明，在750个PitNET的验证队列中，ZEB2和TWIST1在侵入组中的H评分较高（图6d）。
此外，在750个PitNET中，PDL1在TSH和沉默的PIT1临床病理亚型中表现出更高的H-评分（图6e）。200和750个PitNET队列中VEGFR2的IHC染色一致显示其在SF1和NULL肿瘤中的较高表达（图6f）。在750个PitNET验证队列中，与其他谱系相比，EGFR在TPIT谱系中唯一过表达，这也与200个PitNET队列的结果一致（图6g）。EGFR T693磷酸化的IHC染色证实，沉默TPIT亚型中IHC阳性病例的比例明显高于TPIT谱系中ACTH（图6h）。此外，沉默的TPIT亚型中EGFR和EGFR T693磷酸化阳性染色的患者比例明显高于其他谱系（图6i）。
总之，在最初的200个PitNET队列中确定的预后标志物和治疗靶点GNAS、ZEB2、TWIST1、PDL1、VEGFR2、EGFR和EGFR T693磷酸化在750个PitNET队列的相应亚型中得到了验证。这些发现总结在一个PitNET树中，该树显示了一个更新的分类，在该分类中，患者被明确地分为七个簇，以获得潜在的治疗选择（图6j）。
讨论
在这项研究中，基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据集作为公共资源从200个PitNETs和7个APG的回顾性队列中产生。通过对转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据集的综合分析，作者确定了三个基因组事件，包括GNAS突变、GNAS拷贝数增加和USP8突变，以及与更新分类和分层治疗相关的其他几个发现。这项研究是迄今为止PitNET最大的综合蛋白质基因组研究，涵盖了所有十种临床病理亚型。
此外，在750例PitNET病例的独立队列中进一步研究了几种治疗靶点（例如GNAS、CDK6、TWIST1、ZEB2、PDL1、EGFR、EGFR T693磷酸化和VEGFR2）。这种整合的蛋白质基因组分析大大扩展了目前对PitNET病理生理学的理解，并可以指导有效治疗策略的开发和选择。
教授介绍
赵曜，1999年本科毕业于（原）上海医科大学临床医学专业，同年进入华山医院神经外科攻读研究生学位（硕博连读），2004年获博士学位。曾前往美国哈佛医学院附属麻省总医院（MGH）和德国美因茨大学附属医院神经外科接受临床培训。已采用多项微创新技术，开展垂体瘤手术治疗逾千例，疗效显著，论文发表在国际神经外科领域最权威的杂志Neurosurgery上，获世界神经外科联盟主席的高度评价；组建了多学科（神经外科、内分泌科、妇产科、男性科、眼科、放疗科、放射科等）融合的垂体瘤诊疗新体系，使垂体瘤，特别是功能性垂体瘤的综合疗效达国际先进，研究成果被纳入国际临床指南和专家共识，是目前国际上规模最大的垂体瘤诊疗中心之一。
参考文献
Zhang F, Zhang Q, Zhu J, et al. Integrated proteogenomic characterization across major histological types of pituitary neuroendocrine tumors. Cell Res. 2022;10.1038/s41422-022-00736-5. doi:10.1038/s41422-022-00736-5