基于单细胞多组学技术揭示人类结直肠癌的抑瘤微环境

研究表明，较高的肿瘤突变负荷（TMB）预示了免疫检查点抑制剂的更好疗效，但目前仅少数结直肠癌（CRC）患者对PD-1抑制剂有反应，其潜在机制尚不完全清楚。了解肿瘤内细胞类型的复杂性对于解析肿瘤微环境（TME）是至关重要的，TME影响了肿瘤的进展并决定了治疗反应的结果。2021年6月，广州医科大学附属肿瘤医院等研究团队在Clinical and Translational Medicine发表了题为“Single-cell analyses reveal suppressive tumor microenvironment of human colorectal cancer”的文章[1]，在单细胞水平上阐明了异源细胞组成如何决定个体患者的肿瘤微环境，有助于深入了解不同突变负荷状态下的免疫模式。

（图片引自文献[1]）

一、研究策略

选取12例不同癌症分期（I-IV）的CRC患者的癌旁组织、癌前病变组织和肿瘤组织，进行sc RNA-seq、sc ATAC-seq和WES测序。

二、研究思路

三、研究结果

1.构建CRC单细胞转录组和染色质可及性图谱

sc RNA 共获得 6,525 个细胞，鉴定得到 8 个主要细胞类型。sc ATAC 共获得 34,037 个细胞，鉴定得到 11 个细胞类型。这些细胞类型的组成在不同癌症分期（I-IV）、不同组织部位（癌旁、癌前病变和肿瘤）及TMB水平上表现出显著的异质性。此外，作者还进一步展示了不同细胞类型的差异基因表达水平和染色质可及性结果。

图1 CRC单细胞转录组和染色质可及性图谱（图片引自文献[1]）

2.发现了肿瘤特异性Tregs和增殖性耗竭T细胞

作者对T细胞和NK细胞重新聚类，Sc RNA进一步鉴定得到20 个细胞亚型，sc ATAC 进一步鉴定得到 9个细胞亚型。作者发现了两个调节性T细胞（Tregs）亚型，即CTLA4+和CTLA4- Tregs，这两个细胞亚型在结肠癌和非小细胞肺癌中也有发现[2,3]。利用组织偏好性研究发现在癌旁组织中以幼稚T细胞（CD8-TCF7和CD4-CCR7）为主，而在肿瘤中则以耗竭T细胞（CD8-HAVCR2）为主，且耗竭T细胞中TCF7位点的群特异性染色质可及性峰持续减小。

图2 CRC中存在活化的肿瘤Tregs和增殖性耗竭T细胞（图片引自文献[1]）

3.肿瘤基因突变相关T细胞亚群研究

作者接下来对高TMB和低TMB的CRC患者进行单细胞分析，揭示其独特的免疫细胞组成。结果发现高表达CXCL13的Th1/Th17细胞优先在高TMB患者中富集，并对免疫治疗反应良好，表明CXCL13+T细胞可能发挥与微卫星不稳定（MSI）肿瘤中相似的功能，并与检查点阻断的高反应率有关。

图3 TMB相关的T细胞异质性（图片引自文献[1]）

4.肿瘤相关巨噬细胞的功能性研究

作者又对髓系细胞进行重新聚类，sc RNA进一步鉴定得到9个细胞亚型，其中包含4个巨噬细胞（Mφ）亚型。作者发现了混合促炎和抗炎功能的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，其功能不符合M1和M2极化模式，说明TAM比传统的M1和M2分类更具表型和功能多样性。与sc RNA-seq一致的是，sc ATAC发现TAM群中促炎和抗炎基因的启动子都显示出较高的染色质开放性。

图4 CRC中与肿瘤相关的巨噬细胞亚群（图片引自文献[1]）

5.肿瘤相关B细胞和浆细胞功能研究

作者又对B细胞和浆细胞进行重新聚类，鉴定了5个B细胞亚型和5个浆细胞亚型。发现肿瘤组织中驻留记忆B细胞的比例不足，表明B细胞免疫微环境发生了系统性变化。对B细胞免疫功能进行研究，揭示了肿瘤中CD40+和CD27+细胞的抗原提呈作用减弱和抗肿瘤免疫能力减弱。

图5 CRC中与肿瘤相关的B细胞亚群（图片引自文献[1]）

6.非免疫细胞对肿瘤免疫微环境产生影响

作者最后对非免疫细胞进行重新聚类，鉴定得到11个非免疫细胞亚型，其中包含4个成纤维细胞亚型。作者发现了高表达MHC II 类基因和抗原呈递机制基因而不表达共刺激基因的成纤维细胞亚型，表明该成纤维细胞亚型可能具有向T细胞呈递抗原的能力，但不能支持T细胞的完全激活，从而导致T细胞耐受或无能。此外，作者利用细胞通讯分析发现与癌旁组织相比，肿瘤中非免疫细胞和免疫细胞的通讯显著扩张，表明非免疫细胞在塑造肿瘤免疫微环境中起着积极的作用。

图6 CRC中与非免疫细胞潜在作用（图片引自文献[1]）

四、总结

随着单细胞测序技术的飞速发展，利用单细胞RNA和单细胞ATAC多组学结合的研究模式已经成为“常规操作”。该文章整合了sc RNA-seq和sc ATAC-seq 的数据在单细胞水平上阐明了异源细胞组成如何决定个体患者的肿瘤微环境，揭示了免疫细胞和非免疫细胞在塑造肿瘤免疫微环境中的作用。并结合WES数据发现TMB相关的T细胞异质性，有助于不同的免疫模式形成的深入探究。

参考文献：

1. Mei Y, Xiao W, Hu H, et al.Single-cell analyses reveal suppressive tumor microenvironment of human colorectal cancer[J]. Clinical and Translational Medicine, 2021, 11(6):e422.

2. Guo X, Zhang Y, Zheng L, et al.Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature Medicine, 2018, 24:978-985.

3. De Simone M, Arrigoni A,Rossetti G, et al. Transcriptional landscape of human tissue lymphocytes unveils uniqueness of tumor-infiltrating T regulatory cells[J]. Immunity, 2016,45:1135-1147.