实用干货 | 单细胞转录组测序分析—10x参考基因组组装

在单细胞转录组数据分析之前，需要做很多准备工作：1）分析环境的搭建以及各个分析软件的安装；2）参考基因组的选择；3）准备待分析的数据；4）搭建分析流程。与常规的RNA-Seq一样，10x单细胞RNA-Seq也需要测序数据比对到参考基因组进行基因的定量。那么参考基因组的质量就对单细胞的分析结果有着重大的影响。本文主要为大家介绍，分析10x单细胞转录组所需的参考基因组的组装。

参考基因组

参考基因组一般包括两个文件：基因组文件和基因注释文件。

1）参考基因组文件

通常是 fasta格式：以>开头的行标注染色体信息，后续行为该条染色体的碱基信息。

2）基因注释文件

通常有GTF（General Transfer Format）和GFF（generalfeature format）两种，其中 GFF 又可分为GFF3 和 GFF2。这些格式大同小异，主要作用就是注释基因组。上述基因组文件中只有每条染色体的碱基序列，并没有各个基因信息；而 GTF/GFF 文件中包含的是每个转录本的信息。

10x官方提供的参考基因组

对于常用的人和小鼠，10x官方提供了经过处理的，可以直接用来定量的参考基因组，可以在以下链接下载：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest。

人的基因组版本为GRCh38，小鼠的为mm10。都是目前常用的基因组版本，所以如果您研究的是人或者小鼠，可以直接从10x官方下载。

自建参考基因组

如果您希望使用最新的人/小鼠基因组，或者研究的是其他物种，那么就需要自行构建参考基因组了。常用的Ensembl和NCBI数据库都提供了这两种格式的文件。

1）Ensembl

网址：http://asia.ensembl.org

点击Viewfull list of all species，进入搜索列表界面。

可在搜索框中直接输入物种名称，以豚鼠为例，输入cavia porcellus。

点击对应名称，下载参考基因组和基因组注释文件。

下载fasta文件，一般选择*toplevel.fa.gz文件，为参考基因组完整文件，其他rm、sm和分开染色体的文件；sm和rm的意义可看README文件。

下载注释文件，一般选择*gtf.gz文件即可。

下载植物、微生物或者其他物种的基因组文件可打开网址：http://ensemblgenomes.org/，在该网址中进行搜索和下载。

2） NCBI

网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

选择Genome标签，输入物种名称。

点击箭头所示位置下载基因组和基因注释文件。

NCBI下载的基因注释文件一般都是GFF格式，而10x单细胞参考基因组组装需要的是GTF格式的文件，需要格式转换的工具——gffread，这个工具需要在linux操作系统上运行。

a）通过conda安装gffread。

conda install -c bioconda gffread

b） 格式转换，下面这一条命令就可以将gff格式的注释文件转换成gtf格式的文件了。

gffreadgencode.v19.annotation.gff3 -T -o gencode.v19.gtf

c）将gtf格式的文件转换成gff3格式的文件。

gffreadgencode.vM13.annotation.gtf -o gencode.vM13.annotation.gff3

构建参考基因组

处理完GTF文件之后，就可以使用cellranger的mkref命令构建基因组了：

cellrangermkref --genome=cavia_porcellus_output

--fasta=reference/cavia_porcellus/fasta/Cavia_porcellus.Cavpor3.0.dna.toplevel.fa

--genes= reference/cavia_porcellus/genes/Cavia_porcellus.Cavpor3.0.106.gtf

这一步根据基因组的大小，需要的内存和运行时间不同。所以建议在大型工作站或者服务器等配置较高的机器上运行。到这里自己的参考基因组就建好了，下一步就可以执行cellranger对数据进行mapping分析了。

参考资料

Findthe input files -Software -Single Cell Gene Expression -Official 10x GenomicsSupport

刘静  | 文案