无香真水_1c6c
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limma/voom，edgeR，DESeq2分析注意事项，差异分析表达矩阵与分组信息

给粉丝朋友们带来了很多理解上的挑战，所以我们开辟专栏慢慢介绍其中的一些概念性的问题，上一期： 箱线图的生物学含义

这一讲我们来说一下limma/voom，edgeR，DESeq2，转录组差异分析的三大R包!

差异分析的第一步是要构建符合不同模型的R对象，主要包括两部分的信息：表达矩阵和分组信息。 这次主要讨论一下limma/voom，edgeR，DESeq2是转录组差异分析的三大R包的表达矩阵和分组矩阵构建，主要针对二分组转录组数据的差异分析。

一、limma和edgeR包的表达矩阵和分组信息

1.limma和edgeR包DEGList对象的构建

limma和edgeR包都是由一个研究团队开发，方法之间互相继承。edgeR是专门针对转录组数据开发的，limma包最早是用来进行芯片数据的差异分析，对转录组数据差异分析的功能是后来添加的，表达矩阵的构建方法直接使用edgeR包中的DGEList函数。

DEGList函数的参数示例：

DGEList(counts = matrix(0, 0, 0), lib.size = colSums(counts),
 norm.factors = rep(1,ncol(counts)), samples = NULL,
 group = NULL, genes = NULL, remove.zeros = FALSE)

使用airway中的转录组表达矩阵来演示

# BiocManager::install(c("airway", "edgeR"))
 
 
 
  
library(airway)
 data(airway)
 
 
 
 
获取基因counts矩阵
 
 
 
  
exprSet <- assay(airway)
 exprSet[1:6,1:6]
 SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517
 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047
 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0
 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799
 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331
 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63
 ENSG00000000938 0 0 2 0 1 0
 exprSet <- assay(airway)
 
 
 
 
获取分组信息
 
 
 
  
group_list <- colData(airway)$dex
 group_list
 [1] untrt trt untrt trt untrt trt untrt trt
 Levels: trt untrt

使用 DEGList函数构建limma和edgeR包需要的输入矩阵：

> dge <- edgeR::DGEList(counts=exprSet)
 
 
 
  
dge
 An object of class "DGEList"
 $counts
 SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520
 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770
 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0
 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417
 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233
 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63 76
 SRR1039521
 ENSG00000000003 572
 ENSG00000000005 0
 ENSG00000000419 508
 ENSG00000000457 229
 ENSG00000000460 60
 64097 more rows ...
 
 
 
 
$samples
 group lib.size norm.factors
 SRR1039508 1 20637971 1
 SRR1039509 1 18809481 1
 SRR1039512 1 25348649 1
 SRR1039513 1 15163415 1
 SRR1039516 1 24448408 1
 SRR1039517 1 30818215 1
 SRR1039520 1 19126151 1
 SRR1039521 1 21164133 1

可以看到包含了counts矩阵和一些其他用于差异分析要使用的信息，还可以把分组信息添加进来。

> DEG <- edgeR::DGEList(counts=exprSet,group=factor(group_list))
 
 
 
  
DEG
 An object of class "DGEList"
 $counts
 SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520
 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770
 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0
 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417
 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233
 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63 76
 SRR1039521
 ENSG00000000003 572
 ENSG00000000005 0
 ENSG00000000419 508
 ENSG00000000457 229
 ENSG00000000460 60
 64097 more rows ...
 
 
 
 
$samples
 group lib.size norm.factors
 SRR1039508 untrt 20637971 1
 SRR1039509 trt 18809481 1
 SRR1039512 untrt 25348649 1
 SRR1039513 trt 15163415 1
 SRR1039516 untrt 24448408 1
 SRR1039517 trt 30818215 1
 SRR1039520 untrt 19126151 1
 SRR1039521 trt 21164133 1

这些使用方法适用于绝大多数limma和edgeR包差异分析的表达矩阵构建。

2.limma和edgeR包分组矩阵的设置

limma和edgeR的假设都是数据符合正态分布，构建线性模型。 使用model.matrix函数构建分组信息的矩阵，就是将分组信息二值化，用0和1构成的矩阵来代表不同的分组信息。

> design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
 
 
 
  
colnames(design) <- levels(factor(group_list))
 rownames(design) <- colnames(exprSet)
 design
 trt untrt
 SRR1039508 0 1
 SRR1039509 1 0
 SRR1039512 0 1
 SRR1039513 1 0
 SRR1039516 0 1
 SRR1039517 1 0
 SRR1039520 0 1
 SRR1039521 1 0
 attr(,"assign")
 [1] 1 1
 attr(,"contrasts")
 attr(,"contrasts")
 [1] "contr.treatment"
 
 
 
 
需要注意的一点是下面两种构建模型矩阵的区别
 
 
> design <- model.matrix(~factor(group_list))
 
 
 
  
design
 (Intercept) factor(group_list)untrt
 1 1 1
 2 1 0
 3 1 1
 4 1 0
 5 1 1
 6 1 0
 7 1 1
 8 1 0
 attr(,"assign")
 [1] 0 1
 attr(,"contrasts")
 attr(,"contrasts")
 [1] "contr.treatment"
 
 
 
 
 
  
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
 design
 factor(group_list)trt factor(group_list)untrt
 1 0 1
 2 1 0
 3 0 1
 4 1 0
 5 0 1
 6 1 0
 7 0 1
 8 1 0
 attr(,"assign")
 [1] 1 1
 attr(,"contrasts")
 attr(,"contrasts")
 [1] "contr.treatment"
 
 
 
 
第一种方法是将第一列的分组信息作为线性模型的截距，第二列开始依次与第一列比较，通过coef参数可以把差异分析结果依次提取出来。
 
 
第二种方法，仅仅是分组信息而已，需要通过makeContrasts函数来制作差异比较矩阵控制。
 
 
> # 通过makeContrasts设置需要进行对比的分组
 
 
 
  
comp='trt-untrt'
 cont.matrix <- makeContrasts(contrasts=c(comp),levels = design)
 cont.matrix
 Contrasts
 Levels trt-untrt
 trt 1
 untrt -1
 
  
 
二、DESeq2包的表达矩阵和分组信息的构建
 
 
1.DESeq2包输入文件：DESeqDataSet对象的制作
 
 
构建DESeqDataSet函数的参数示例：
 
 
DESeqDataSet(se, design, ignoreRank = FALSE)
 
 
DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData, design, tidy = FALSE,
 ignoreRank = FALSE, ...)
 
 
DESeqDataSetFromHTSeqCount(sampleTable, directory = ".", design,
 ignoreRank = FALSE, ...)
 
 
DESeqDataSetFromTximport(txi, colData, design, ...)
 
 
DESeqDataSet使用示例：从SummarizedExperiment流程中产生的数据导入
 
 
> library(airway)
 
 
 
  
data(airway)
 ddsSE <- DESeq2::DESeqDataSet(airway, design = ~ cell + dex)
 ddsSE
 class: DESeqDataSet
 dim: 64102 8
 metadata(2): '' version
 assays(1): counts
 rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99
 rowData names(0):
 colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521
 colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample
 
 
  
 
DESeqDataSetFromMatrix使用示例：从count矩阵中构建DESeqDataSet：
 
 
> colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet),group_list=group_list)
 
 
 
  
dds <- DESeq2::DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,colData = colData, design = ~ group_list)
 dds
 
 
 
 
class: DESeqDataSet
 dim: 64102 8
 metadata(1): version
 assays(1): counts
 rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99
 rowData names(0):
 colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521
 colData names(1): group_list
 
 
DESeqDataSetFromHTSeqCount使用示例：从HTSeqCount中导入数据
 
 
# 指定表达矩阵文件所在的文件夹
 
 
 
  
directory <- system.file("extdata", package="pasilla",
 
 
 
 
     
  
  •                      mustWork=TRUE)

    •  
 
 
 
 
  
directory
 [1] "/Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.6/Resources/library/pasilla/extdata"
 sampleFiles <- grep("treated",list.files(directory),value=TRUE)
 sampleFiles
 [1] "treated1fb.txt" "treated2fb.txt" "treated3fb.txt" "untreated1fb.txt"
 [5] "untreated2fb.txt" "untreated3fb.txt" "untreated4fb.txt"
 sampleCondition <- sub("(.treated).","\1",sampleFiles)
 sampleCondition
 [1] "treated" "treated" "treated" "untreated" "untreated" "untreated" "untreated"
 
 
 
 
构建包含表达矩阵文件信息的数据框
 
 
 
  
sampleTable <- data.frame(sampleName = sampleFiles,
 
 
 
 
     
  
  •                       fileName = sampleFiles,

    •  
  
  •                       condition = sampleCondition)

    •  
 
 
 
导入为DESeqDataSet对象
 
 
 
  
ddsHTSeq <- DESeq2::DESeqDataSetFromHTSeqCount(sampleTable = sampleTable,
 
 
 
 
     
  
  •                                    directory = directory,

    •  
  
  •                                    design= ~ condition)

    •  
 
 
 
 
  
ddsHTSeq
 class: DESeqDataSet
 dim: 70463 7
 metadata(1): version
 assays(1): counts
 rownames(70463): FBgn0000003:001 FBgn0000008:001 ... FBgn0261575:001
 FBgn0261575:002
 rowData names(0):
 colnames(7): treated1fb.txt treated2fb.txt ... untreated3fb.txt untreated4fb.txt
 colData names(1): condition
 
  
 
DESeqDataSetFromTximport使用示例：通过Tximport导入不基于比对的基因定量矩阵，主要是以下四个常用软件
 
 
     
  
  • Salmon (Patro et al. 2017)
    •  
  
  • Sailfish (Patro, Mount, and Kingsford 2014)
    •  
  
  • kallisto (Bray et al. 2016)
    •  
  
  • RSEM (Li and Dewey 2011)
    •  
 
 
 
# 加载R包及示例数据
 
 
 
  
library("tximport")
 library("readr")
 library("tximportData")
 dir <- system.file("extdata", package="tximportData")
 
 
 
 
设置分组信息
 
 
 
  
group_list <- factor(rep(c("A","B"),each=3))
 
 
 
 
获取表达矩阵所在的文件夹，salmon的结果为例
 
 
files <- list.files(file.path(dir,"salmon"),pattern = "*quant.sf.gz", recursive = TRUE)
 full_files_path <- file.path(dir,"salmon",files)
 
 
读入转录本和基因对应列表
 
 
 
  
tx2gene <- read_csv(file.path(dir, "tx2gene.gencode.v27.csv"))
 Parsed with column specification:
 cols(
 TXNAME = col_character(),
 GENEID = col_character()
 )
 head(tx2gene)
 
 
 
 
A tibble: 6 x 2
 
 
TXNAME GENEID
  
 1 ENST00000456328.2 ENSG00000223972.5
 2 ENST00000450305.2 ENSG00000223972.5
 3 ENST00000473358.1 ENSG00000243485.5
 4 ENST00000469289.1 ENSG00000243485.5
 5 ENST00000607096.1 ENSG00000284332.1
 6 ENST00000606857.1 ENSG00000268020.3
 
 
txi倒入需要两个参数：表达矩阵所在路径和基因转录本对应的列表
 
 
 
  
txi <- tximport(full_files_path, type="salmon", tx2gene=tx2gene)
 reading in files with read_tsv
 1 2 3 4 5 6
 summarizing abundance
 summarizing counts
 summarizing length
 sampleName<- c("ERR188021", "ERR188088", "ERR188288","ERR188297", "ERR188329", "ERR188356")
 colData <- cbind(sampleName, group_list)
 ddsTxi <- DESeq2::DESeqDataSetFromTximport(txi,
 
 
 
 
     
  
  •                                        colData = colData,

    •  
  
  •                                        design = ~ group_list)

    •  
 
 
 
using counts and average transcript lengths from tximport
 
 
 
  
ddsTxi
 class: DESeqDataSet
 dim: 58288 6
 metadata(1): version
 assays(2): counts avgTxLength
 rownames(58288): ENSG00000000003.14 ENSG00000000005.5 ... ENSG00000284747.1
 ENSG00000284748.1
 rowData names(0):
 colnames: NULL
 colData names(2): sampleName group_list
 
  
 
2.DESeq2分组信息的设置
 
 
DESeq2的差异分析的分组信息设置比较简单，主要通过resuls函数实现
 
 
results(object, contrast, name, lfcThreshold = 0,
 altHypothesis = c("greaterAbs", "lessAbs", "greater", "less"),
 listValues = c(1, -1), cooksCutoff, independentFiltering = TRUE,
 alpha = 0.1, filter, theta, pAdjustMethod = "BH", filterFun,
 format = c("DataFrame", "GRanges", "GRangesList"), test,
 addMLE = FALSE, tidy = FALSE, parallel = FALSE,
 BPPARAM = bpparam(), minmu = 0.5)
 
 
resultsNames(object)
 
 
removeResults(object)
 
 
使用示例：
 
 
results(dds, contrast=c("condition","C","B"))
 
 
dds代表DESeq2得到了差异分析的结果，contrast的输入一个长度为3的向量，与上面构建DESeqDataSet时输入的分组信息对应。
 
 
# 如输入的分组信息是如下的因子向量
 
 
 
  
group_list
 [1] A A A B B B
 Levels: A B
 
 
 
 
提取A和B差异分析结果的示例如下，A代表对照组，B代表处理组，注意先后顺序，与edgeR正好相反
 
 
results(dds, contrast=c("group_list","B","A"))
 
 
三、总结
 
 
limma，edgeR，DESeq2三大包基本是做转录组差异分析的金标准，大多数转录组的文章都是用这三个R包进行差异分析。 edgeR差异分析速度快，得到的基因数目比较多，假阳性高（实际不差异结果差异）。 DESeq2差异分析速度慢，得到的基因数目比较少，假阴性高（实际差异结果不差异）。 需要注意的是制作分组信息的因子向量是，因子水平的前后顺序，在R的很多模型中，默认将因子向量的第一个水平看作对照组。
 
 
四、假如是多个分组呢
 
 
比如，大家都知道，TCGA的乳腺癌可以分成PAM50的5类，那么差异分析就复杂了，大家可以拿我3年前的WGCNA的教程做例子，下面是分组信息啦
 
 
 
  
 
   
  
   
 
  
 
  

    image 
  
 
 
 
 
这个时候有两个策略来做差异分析，当然，分组比较多的时候，差异分析并不是最好的策略啦，WGCNA等其它算法更好！
 
 
策略1：在分组信息里面挑选
 
 
参考我GitHub代码， https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/10-RNA-seq-3-groups
 
 
group_list
 cont.matrix=makeContrasts(contrasts=c('treat_12-control','treat_2-control'),levels = design)
 fit2=contrasts.fit(fit,cont.matrix)
 fit2=eBayes(fit2)
 
 
tempOutput = topTable(fit2, coef='treat_12-control', n=Inf)
 DEG_treat_12_limma_voom = na.omit(tempOutput)
 write.csv(DEG_treat_12_limma_voom,"DEG_treat_12_limma_voom.csv",quote = F)
 
 
tempOutput = topTable(fit2, coef='treat_2-control', n=Inf)
 DEG_treat_2_limma_voom = na.omit(tempOutput)
 write.csv(DEG_treat_2_limma_voom,"DEG_treat_2_limma_voom.csv",quote = F)
 
 
在提取差异分析结果的时候，需要指定是哪个组和哪个组在进行比较。
 
 
值得一提的是， 我的GitHub简直就是宝藏，我上面提到的3年前的WGCNA的教程做例子，最近看到有两个文章就拿同样的数据代码和图片发了一个4分，一个5分的文章！！！
 
 
     
  
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31382519
    •  
  
  • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6639467/
    •  
 
 
 
你懂得！
 
 
策略2：提取子矩阵和子分组信息
 
 
这个很容易理解了，把表达矩阵根据自己想要进行的两两比对来筛选即可，这样就可以多次做差异分析啦，而且保证每次都只有两个分组。
 
 
参考资料
 
 
http://www.bio-info-trainee.com/1514.html http://www.bio-info-trainee.com/255.html http://www.bio-info-trainee.com/1533.html https://ucdavis-bioinformatics-training.github.io/2018-June-RNA-Seq-Workshop/thursday/DE.html http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html https://rdrr.io/bioc/DESeq2/man/DESeqDataSet.html https://rdrr.io/bioc/DESeq2/man/results.html https://rdrr.io/bioc/limma/man/11RNAseq.html

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    摘要：本文探讨了店群合一的社区团购平台在当今商业环境中的重要性和优势。通过分析店群合一模式如何将互联网社群与线下终端紧密结合，阐述了链动2+1模式、AI智能名片和S2B2C商城小程序源码在这一模式中的应用价值。这些创新元素的结合为社区团购带来了新的机遇，提升了用户信任感、拓展了营销渠道，并实现了线上线下的完美融合。一、引言随着互联网技术的不断发展，社区团购作为一种新兴的商业模式，在满足消费者日常需
  • 2021-08-26 影幽
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    在数据驱动的时代，Python因其简洁的语法、强大的库生态系统以及活跃的社区，成为了数据分析与可视化的首选语言。本文将通过一个详细的案例，带领大家学习如何使用Python进行数据分析，并通过可视化来直观呈现分析结果。一、环境准备1.1安装必要库在开始数据分析和可视化之前，我们需要安装一些常用的库。主要包括pandas、numpy、matplotlib和seaborn等。这些库分别用于数据处理、数学
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    贵州领航建设有限公司诉贵州纳雍隆庆乌江水泥有限公司产品质量纠纷案代理词尊敬的审判长、审判员：贵州千里律师事务所接受被告贵州纳雍隆庆乌江水泥有限公司的委托，指派我担任其诉讼代理人，参加本案的诉讼活动。下面，我结合本案事实和相关法律规定发表如下代理意见，供合议庭评议案件时参考：原告应当举证证明其遭受的损失与被告生产的水泥质量的因果关系。首先水泥是一种粉状水硬性无机胶凝材料。加水搅拌后成浆体，能在空气中
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        本文将介绍如何在CentOS上运行Java Web服务，其中将包括如何搭建JAVA运行环境、如何开启端口号、如何使得服务在命令执行窗口关闭后依旧运行     第一步：卸载旧Linux自带的JDK ①查看本机JDK版本 java -version    结果如下 java version "1.6.0"
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    oracle                                &n
  • 记Protocol Oriented Programming in Swift of WWDC 2015 ningandjin protocolWWDC 2015Swift2.0
    其实最先朋友让我就这个题目写篇文章的时候，我是拒绝的，因为觉得苹果就是在炒冷饭， 把已经流行了数十年的OOP中的“面向接口编程”还拿来讲，看完整个Session之后呢，虽然还是觉得在炒冷饭，但是毕竟还是加了蛋的，有些东西还是值得说说的。 通常谈到面向接口编程，其主要作用是把系统设计和具体实现分离开，让系统的每个部分都可以在不影响别的部分的情况下，改变自身的具体实现。接口的设计就反映了系统
  • 搭建 CentOS 6 服务器(15) - Keepalived、HAProxy、LVS rensanning keepalived
    （一）Keepalived （1）安装 # cd /usr/local/src # wget http://www.keepalived.org/software/keepalived-1.2.15.tar.gz # tar zxvf keepalived-1.2.15.tar.gz # cd keepalived-1.2.15 # ./configure # make &a
  • ORACLE数据库SCN和时间的互相转换 tomcat_oracle oraclesql
    SCN（System Change Number 简称 SCN）是当Oracle数据库更新后，由DBMS自动维护去累积递增的一个数字，可以理解成ORACLE数据库的时间戳，从ORACLE 10G开始，提供了函数可以实现SCN和时间进行相互转换； 　　 用途：在进行数据库的还原和利用数据库的闪回功能时，进行SCN和时间的转换就变的非常必要了； 　 　操作方法： 　　1、通过dbms_f
  • Spring MVC 方法注解拦截器 xp9802 spring mvc
    应用场景，在方法级别对本次调用进行鉴权，如api接口中有个用户唯一标示accessToken,对于有accessToken的每次请求可以在方法加一个拦截器，获得本次请求的用户，存放到request或者session域。 python中，之前在python flask中可以使用装饰器来对方法进行预处理，进行权限处理 先看一个实例,使用@access_required拦截： ?
按字母分类： ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ其他