今天跟大家分享的是一月份发表在Clinical Cancer Research（IF：8.911）杂志上的一篇文章关于趋化因子的文章。作者基于胰腺导管腺癌(PDAC)的4种趋化因子特征在免疫特征(免疫细胞，免疫检查点相关基因，免疫相关通路，免疫原性和免疫得分)等方面做了系统分析，并揭示了4种趋化因子特征与PDAC的T细胞炎性表型具有关联。
A four-chemokine signature is associated with a T cell-inflamed phenotype in primary and metastatic pancreatic cancer
原发性和转移性胰腺癌中与T细胞炎性相关的4种趋化因子特征
一.研究目的
目前，有关胰腺导管腺癌(PDAC)中潜在的驱动分子的研究甚少。多项研究表明效应性T淋巴细胞(如CD8+T细胞)作为引发免疫检查点抑制剂反应的重要因素，与患者较好的预后有关。然而，较低的免疫原性，肿瘤突变负荷和抑制性肿瘤免疫微环境使PDAC的免疫治疗研究具有更大挑战性。因此，作者等人基于趋化因子表达和效应T细胞的浸润在PDAC中开展进一步研究，为筛选获益亚组的预测生物标志物提供理论指导。
二.方法解读
(一)队列数据
1.发现队列：
COMPASS 临床试验(NCT02750657)
- 原发灶切除的PDAC(n=113例)-->激光捕捉显微切割技术(LCM)纯化肿瘤样本-->112例全基因组测序(WGS)&113例全转录组测序数据(RNA-seq)
- 肝脏转移的PDAC(n=107例)-->激光捕捉显微切割技术(LCM)纯化肿瘤样本-->103例全基因组测序(WGS)&全转录组测序数据(RNA-seq)
2.验证队列：
- TCGA-PDAC(n=182例) (来自https://tcga-data.nci.nih.gov, 2018发表)
- ICGC-PDAC(n=92例) (来自https://dcc.icgc.org/projects/PACA-AU, 2018年10月下载)
(二)免疫细胞定量
- 使用组织微阵列(TMA)检测肿瘤内CD3，CD8，CD4和FOXP3
- 使用QuPath Bioimage分析软件对CD8+TILs的数目计算(基于肿瘤区域进行标准化)；并经log2转换。
- 最后具有CD8+TILs和RNA-seq的79例原发灶切除PDAC用于分析趋化因子表达与CD8+TILs浸润。
(三)免疫组化和趋化因子染色
- FFPE样本(10例原发灶切除的PDAC)：CCL4/MIP-1β；CCL5/RANTES；CXCL9/MIG；CXCL10/IP-10；CD11c和CD8
(四)RNA-seq数据和分析
- 免疫基因功能定义：来自InnateDB数据库
- ssGSEA：过滤基因(去除Raw TPM<0.01 & <70%样本表达)-->基于基因表达量的中位数计算FC(FC>50-->FC=50)-->Log2转换-->GSVA包 (kcdf="Gaussian";min.sz=2;max.sz=500)-->基因集：免疫细胞，免疫相关通路和T细胞炎性相关标志(去除4种趋化因子)--->进行ssGSEA分析
- mRNA表达量：过滤基因(保留编码蛋白基因)-->Normalization: 使用15个管家基因表达量的中位数-->log2转换 (TPM值)
- 免疫分数计算：CYT活性得分和Batf3依赖的树突状细胞得分(标准化后基因表达量的均值)
- 差异分析：edgeR包-->保留至少在75%患者中count≥25的编码蛋白基因 & FDR<0.05
- GSEA：edgeR包分析 (4种趋化因子-高 versus 4种趋化因子-低)-->基因集：Hallmark和C2:Canonical Pathway-->FDR < 0.05-->Cytoscape(可视化)
(五)统计分析
- R (v3.5.1)：统计分析 (Benjamini-Hochberg多重校正P值)和绘图(ggplot2包)
三.结果解读
1.PDAC中的CD8+T细胞浸润与特定趋化因子有关
通过组织微阵列免疫组织化学染色观察到大多数PDAC包含CD8+TILs (图1A)。作者进一步发现4种趋化因子(CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10)的表达与CD8+TIL数量呈显著正相关(图1B)。此外，PDAC组织中具有CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10蛋白的表达(图1C)。4种趋化因子的表达与单核苷酸变异(SNV)或新抗原(Neoantigen)均无相关性(图1D)。在MMRd/HRD分组中，CD8+TIL数量与SNV呈显著正相关(图1E, 右)。
图1. PDAC中CD8+ T细胞浸润与趋化因子有关且独立于突变负荷
2.趋化因子signature通过独特的免疫特性区分原发性PDAC
基于113例原发灶切除的PDAC的RNAseq数据(非-MMRd/HRD)对趋化因子进行相关性分析(Spearman)并以相关性热图展示，4种趋化因子表达量之间均呈现显著正相关(all P < 0.01)，且CXCL11也与CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10表达呈现显著正相关，但其与CD8+ TIL数量不具有显著正相关。基于4种趋化因子的共表达均值并使用四分位数划分PDAC人群(n=113)，将其分为4种趋化因子-高(n=29)；4种趋化因子-中(n=55)和4种趋化因子-低(n=29)。接着，基于4种趋化因子-高和4种趋化因子-低分组使用edgeR包进行差异分析，火山图显示有245个上调(包括T细胞衰竭的标志物IDO1基因)和35个下调基因；通过热图显示4种趋化因子-高组具有更多的免疫活性相关基因(IL2RB，IL2RA，ZAP70，ITK，CD8A，CD3E，CD38)。edgeR包差异分析后的差异基因经去除CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10后进行GSEA分析，并使用Cytoscape进行可视化(图2D)。结果显示，4种趋化因子-高组中富集固有免疫相关通路(如免疫活化，MHC-II呈递和抗原呈递等)和KRAS相关通路。
图2. 4种趋化因子表达的Panel以独特的免疫特性区分PDAC
3.趋化因子signature通过独特的免疫细胞谱区分原发性PDAC
接着，作者使用ssGSEA分析证明了4种趋化因子-高组具有更高活性的免疫细胞浸润(图3A)。利用IHC证明了原发性PDAC组织中具有更多数目CD8+T，CD3+T和FOXP3+细胞，然而CD4+T细胞在2组之间无明显差异(图3B)。
4.趋化因子signature与原发性PDAC的T细胞炎性转录特征有关
4种趋化因子-高组表现出具有显著增高的CYT得分(提示功能活跃的细胞毒性淋巴细胞；图3B)，T细胞共刺激程度和IFN-I/II表达(图3C)。此外，4种趋化因子-高组具有更高的免疫检查点相关基因的表达(图3D)和T细胞炎性相关表达谱(图3E)。
图3.4种趋化因子-高组揭示了PDAC患者具有抗肿瘤表型
5.趋化因子signature与原发性原发性PDAC的专职抗原递呈细胞(APCs)和固有免疫通路有关。
4种趋化因子-高组具有更高水平的MHC-I，共刺激APC(图4A)和Batf3依赖的树突状细胞得分(图4C)。此外，IHC证明了CD11C(DCs标志物)和CD8(CD8+T细胞标志物)均存在于4种趋化因子-高组的组织中。进一步对干扰素基因刺激(STING)和炎性体途径(NLRP3)这2个基因集的ssGSEA分析中显示了4种趋化因子-高组具有更高的得分(图4D)。
图4. APC活化与4种趋化因子Panel有关
6.在ICGC和TCGA队列中验证上述结果
4种趋化因子的表达在TCGA队列中呈显著正相关(图5A)。此外，4种趋化因子-高组在免疫细胞，CTY得分，T细胞炎性的ssGSEA得分，免疫检查点相关基因，DCs得分和细胞因子得分均显著高于4种趋化因子-低组(图5)。ICGC队列与上述结果一致(见文章补充材料)。
图5. 4种趋化因子表达与T细胞炎性表型的关联性于TCGA-PDAC这一独立队列得以验证
7.肝脏转移的PDAC显示出T细胞炎性表型
接着，作者对肝脏转移的PDAC进行分析，相关性热图显示肝脏转移的PDAC中CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10表达呈现显著正相关 (图6A)。趋化因子表达水平进行分组后分析免疫细胞，CTY得分，T细胞炎性的ssGSEA得分，免疫检查点相关基因，DCs得分和细胞因子得分在4种趋化因子-高组和4种趋化因子-低组的差异，结果显示肝脏转移的PDAC也具有T细胞炎性的特征(图6)。此外，作者总结了互补机制模型来解释PDAC中抗肿瘤免疫力(图6G)：在MMR/HRD PDAC中，经典的免疫治疗预测标志物(如TMB)将更为适用；而对于非MMR/HRD PDAC而言，4种趋化因子signature(CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10)可能更有利于区分T细胞炎性与否这一表征。
图6. 肝转移PDAC中4种趋化因子表达与活化的免疫表型有关
到这里文章的主要内容就介绍完了，文章对胰腺导管腺癌(PDAC)的4种趋化因子与免疫特征(免疫细胞，免疫检查点相关基因，免疫相关通路，免疫原性和免疫得分)等做了详细研究。该研究基于独立队列(COMPASS 临床试验: NCT02750657)的全转录组测序和全基因组测序数据发现了4种趋化因子-高组具有显著增加的CD8+TILs浸润和更高的免疫活性特征，并利用IHC证明了PDAC组织中存在免疫细胞和免疫相关的蛋白。此外，作者还基于公共数据库(TCGA和ICGA)进一步验证上述结果。该研究的主要分析方法为差异分析，GSEA分析，ssGSEA分析，相关性分析等等生物信息方法，做肿瘤微环境的小伙伴可以借鉴研究涉及到的分析方法以及流程。