Nature丨基因组筛选T细胞增殖驱动因子
原创 珍奇 图灵基因 2022-03-29 09:48
收录于话题#前沿分子生物学机制
撰文：珍奇
IF：49.962
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亮点：
本研究通过将带条形码的人类开放阅读框 (ORF) 进行过表达处理来识别 T 细胞功能的正调节因子；由此开发了单细胞基因组学方法 OverCITE-seq，用于高通量定量 ORF工程 T 细胞中的转录组和表面抗原；发现了当在 T 细胞中过表达时，LTBR 诱导了深刻的转录和表观基因组重塑，通过经典 NF-κB 通路的组成性激活，导致 T 细胞效应功能和对慢性刺激环境中的衰竭抵抗力增加；s研究结果提供了几种通过诱导合成细胞程序来改进下一代 T 细胞疗法的策略。
使用自体患者 T 细胞的过继细胞疗法已经彻底改变了多种癌症的治疗方法。然而，基于CRISPR的功能丧失筛选仅限于 T 细胞功能的负调节因子，并且由于基因组的永久性修改而引起了安全问题。因此，该技术仍需要进一步改进以提高反应和治愈率。2022年3月16日，纽约大学Neville E. Sanjana课题组在《Nature》杂志上发表了一篇名为“A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation”研究型文章。他们研究表明，在来自健康供体和血癌患者的 CD19 导向 CAR T 细胞和广泛的肿瘤反应性 γδ T 细胞的背景下，排名靠前的 ORF 可增强抗原特异性 T 细胞功能。
在本研究中，作者首先使用了 ORF 文库来研究响应 T 细胞受体 (TCR) 刺激促进 CD4+和 CD8+ T 细胞增殖的基因。为了提高对汇总筛选中排名靠前的 ORF 的可信度，他们评估了与给定 ORF 相对应的单个条形码在增殖 CD4 和 CD8 细胞中的富集度。其中，淋巴毒素-β受体（LTBR）的基因富集最显著，该基因在基质细胞和骨髓细胞中广泛表达，但在淋巴细胞中完全不存在。结果显示，富集的 ORF 跨越了一系列不同的生物过程，且合并的 ORF 筛选发现能够使 T 细胞增殖但在 CD3/CD28 介导的激活和增殖过程中不正常表达的基因的能力。为了随后的验证，他们决定测试广泛的 ORF，这些ORF 在与 T 细胞适应性相关的不同途径中发挥作用，并显示出不同的内源性调节模式。
图1. 基因组规模的过表达筛选，以识别促进原代人类 T 细胞增殖的基因
为了验证排名靠前的 ORF 并了解它们对 T 细胞功能其他相关方面的影响，他们将文库中的 33 个 ORF 亚克隆到一个载体中，该载体共表达来自同一启动子的 P2A 连接的嘌呤霉素抗性基因。他们选择了一种缺乏细胞内结构域的截断神经生长因子受体 (tNGFR)作为对 T 细胞表型没有影响的对照。 CD4+ 和 CD8+ 群体分别从几个独立于筛选的健康供体中分离出来，并用单个 ORF 进行转导。他们发现，与 tNGFR 相比，16 个测试的 ORF 显着改善了细胞增殖，并且增殖在 CD4+ 和 CD8+ 细胞之间具有很好的相关性。在确定顶级 ORF 改善 T 细胞增殖后，他们接下来测试了其他 T 细胞表型和功能是否也有变化。大多数测试的 ORF 显示循环没有差异，但在刺激后 T 细胞中 CD25 和CD154 的表达更高，进一步证实了它们的效果在提高 T 细胞反应的幅度方面。最后，他们测量了用 CD3/CD28 再刺激后细胞因子白细胞介素 2（IL-2）和 IFNγ 的分泌。尽管他们的筛选并非旨在识别调节细胞因子分泌的基因，但几个 ORF 可以改善 T 细胞增殖并促进 IL-2 或 IFNγ 分泌。观察到 LTBR 的效果最强，它使 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中这两种细胞因子的分泌增加了五倍以上。
图2. 排名靠前的 ORF 的过表达增加了 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的增殖、活化和细胞因子分泌。
基于对ORF如何影响增殖、激活和细胞因子释放的量化，他们接下来试图更好地了解驱动这些细胞状态变化的潜在机制。为了更全面地了解单个 ORF 的作用机制，并提供它们引起的表型变化的多维特征，他们开发了一种直接捕获 ORF 的单细胞测序策略。这种方法 OverCITE-seq（通过测序对转录组和表位进行过表达兼容的细胞索引）扩展了他们之前开发的用于量化表面抗原和 CRISPR 扰动的方法，并允许对池进行高通量单细胞分析具有不同 ORF 的 T 细胞。他们优化了 OverCITE-seq 并将其应用于从健康供体转导到 CD8+ T 细胞中的大约 30 个 ORF。在这些激活驱动的超级集群中，他们可以观察到与特定细胞状态或功能相关的单个集群。尽管在许多情况下，几个 ORF 对给定的簇表型有贡献，但他们观察到簇 1 中CDK1 和 CLIC1 的显着富集，其特征是负责染色体凝聚的基因表达增加为细胞周期做准备。观察到簇 10 的富集更强，它几乎完全由表达 LTBR 的细胞组成。
图3. 单细胞 OverCITE-seq 可识别由 T 细胞中基因过表达诱导的共享和不同的转录程序。
确定了 LTBR 是促炎细胞因子分泌和深刻的转录重塑的强大驱动力后，他们决定更详细地研究其作用机制。LTBR 属于肿瘤坏死因子受体超家族 (TNFRSF)，在多种非免疫细胞类型和骨髓来源的免疫细胞上表达，但在淋巴细胞中不存在。LTBR 信号在其内源性环境中（在骨髓细胞中）由淋巴毒素-α (LTA) 和淋巴毒素-β (LTB) 的异源三聚体或LIGHT（由 TNFSF14 基因编码）触发。他们发现尽管 LTBR 可以增强 TCR 驱动的 T细胞反应，但它本身并不能驱动激活——这将是一个潜在的安全问题，并导致工程 T 细胞反应的抗原特异性丧失。他们还确定 LTBR 的组成型表达是维持其表型所必需的，但在可检测的 LTBR 表达丧失和表型丧失之间存在相当大的滞后时间，表明 LTBR 的瞬时表达可能成为治疗应用的安全途径。
LTBR 过表达显示诱导 T 细胞广泛的转录组变化，并伴随着 T 细胞功能的变化。因此，他们试图确定 LTBR 细胞中基因表达的扰动是否伴随着表观遗传改变，利用通过测序(ATAC-seq) 对转座酶可接近染色质的测定。值得注意的是，NF-κB p65 和 NFAT-AP-1 是刺激和静息 T 细胞（LTBR 和 tNGFR）中开放染色质中最丰富的两个转录因子，这与它们在 T 细胞活化中的公认作用一致，但只有 NF-κB p65 在 LTBR 细胞中显示出强烈的富集。该结果表明 LTBR 诱导部分 T 细胞激活状态，但仍需要信号 1（TCR刺激）才能完全激活。随后，他们决定研究 NF-κB 信号通路成员的蛋白质表达和/或磷酸化的变化。他们观察到 p65 (RELA) 的磷酸化更快，并且 NF-κB 抑制剂 IκBα 的磷酸化强烈增加，靶向 IκBα 进行降解；这两种效应都增强了 NF-κB 的激活或转录。除了经典 NF-κB 通路的变化外，他们还检测到非经典 NF-κB 通路的关键介质 RELB 和 NF-κB p52 的上调。为了研究经典与非经典 NF-κB 信号在 LTBR T 细胞中的潜在作用，他们决定分析 RELA 或 RELB 丢失对 LTBR 驱动的基因表达谱的整体影响。在过表达LTBR 或 tNGFR 的 T 细胞上使用大量 RNA-seq，他们发现只有 RELA 的缺失显着下调了“核心”LTBR 基因的表达，而 RELB 的缺失没有影响。
图4. LTBR 过表达通过激活经典的 NF-κB 通路来改善 T 细胞功能。
到目前为止，他们已经证明来自 ORF 筛选的顶级基因使用非特异性泛 TCR 刺激改善了T 细胞功能。接下来他们试图确定是否可以使用抗原特异性刺激观察到类似的改善。为此，他们与两个 FDA 批准的靶向 CD19（一种 B 细胞标记物）的 CAR 共同表达了几个排名靠前的基因。由于两种 CAR 使用不同的共刺激域，来自 CD28 或 4-1BB，他们想确定使用 CD28 共刺激选择的顶级基因是否也可以在 4-1BB 共刺激的背景下工作。除 AKR1C4 外，几乎所有排名靠前的基因都改善了 CD25 的上调和抗原特异性细胞因子分泌，分化或耗竭表型没有重大差异。
图5. 排名靠前的基因改善抗原特异性 T 细胞反应和肿瘤杀伤
综上，本研究开发了一种在原代人类 T 细胞中进行基因组规模的功能增益筛选，这种方法依赖于通过供体 DNA 和 Cas9 介导的靶向插入来传递构建体。尽管使用供体 DNA进行靶基因递送可以在构建体设计方面提供更大的灵活性，但与这里使用的慢病毒库相比，该方法在成本和复杂性方面的可扩展性和可访问性较差。因此，研究者相信基于ORF 的功能增益筛选更适用于过多的 T 细胞表型和环境，并且为有效的临床转化提供了机会。
教授介绍：
Neville Sanjana，纽约大学生物学助理教授。他的研究团队主要通过使用多学科方法，结合基因组工程、汇集基因筛选、生物信息学、电生理学和成像等技术，对人类基因组的内部运作及其在自闭症和肿瘤进化中的功能障碍进行剖析。此外，他们还利用用于大规模 DNA 合成、基因编辑和下一代测序的新技术来开发用于正向遗传筛选的 RNA引导核酸酶库（例如 CRISPR）。通过使用该技术，他们已经确定了黑色素瘤耐药性的新遗传驱动因素、体内转移的驱动因素以及肿瘤用于逃避免疫治疗的机制。
参考文献：
Legut, M., Gajic, Z., Guarino, M.et al.A genome-scalescreen for synthetic drivers of T cell proliferation.Nature603, 728–735(2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04494-7