Nat Biotech | 人工合成内含子选择性消除肿瘤细胞
原创 huacishu 图灵基因
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：huacishu
IF=54.908
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亮点：
1、作者描述了一种利用异常剪接活性来驱动剪接因子突变依赖性基因表达的方法，用以选择性地消除肿瘤细胞；
2、向白血病、乳腺癌和黑色素瘤细胞输送含有HSV–TK结构的合成内含子，并在体内进行GCV治疗，可显著抑制这些致命异种移植物的生长，提高小鼠存活率。合成内含子提供了一种利用肿瘤特异性RNA剪接变化进行癌症基因治疗的方法。
纪念斯隆-凯特琳癌症中心Omar Abdel Wahab教授课题组在国际知名期刊Nat Biotechnol在线发表题为“Synthetic introns enable splicing factor mutation-dependent targeting of cancer cells”的论文。许多癌症都带有影响RNA剪接因子的功能突变。本文中描述了一种利用这种异常剪接活性来驱动剪接因子突变依赖性基因表达的方法，用以选择性地消除肿瘤细胞。作者设计了合成内含子，这些内含子在携带SF3B1突变的癌细胞中能够有效拼接，但在其他同基因野生型细胞中未能拼接。一个由8878个内含子组成的大规模平行筛查描绘了理想的内含子大小，并绘制了突变依赖性剪接的基本元素。合成内含子使单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）的突变依赖性表达和随后的更昔洛韦（GCV）介导的体外杀死SF3B1突变型白血病、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌细胞，同时使野生型细胞不受影响。向白血病、乳腺癌和黑色素瘤细胞输送含有HSV–TK结构的合成内含子，并在体内进行GCV治疗，可显著抑制这些致命异种移植物的生长，提高小鼠存活率。合成内含子提供了一种利用肿瘤特异性RNA剪接变化进行癌症基因治疗的方法。
首先确定了内含子对SF3B1突变反应最强烈且一致的内源性基因，这些突变几乎普遍以杂合、错义变化的形式存在。作者查询了35个癌症队列的转录组，以确定20种癌症类型SF3B1突变样本，共有271份患者样本携带SF3B1突变。在SF3B1突变样本中，相对于WT癌症以及健康供体组织，有一个子集表现出高度一致的差异剪接（图1a，b）。SF3B1突变与多种剪接变化有关，包括改变的3′剪接位点（3′ss）选择、外显子识别和内含子保留。选择代表两类剪接事件的六个内含子进行进一步研究。SF3B1突变激活MAP3K7、ORAI2和TMEM14C中的内含子近端3′ss，并促进MTERFD3、MYO15B和SYTL1中的内含子去除（图1c）。这些是最强且最一致的错误剪接事件之一，优先导致SF3B1突变样本中的开放阅读框中断（MAP3K7、ORAI2和TMEM14C）或保存（MTERFD3、MYO15B和SYTL1）。在原发性MDS和AML患者样本的RNA测序（RNA seq）数据中观察到的与SF3B1相关的突变错误剪接，在白血病（K562）和B细胞急性淋巴细胞白血病（NALM-6）细胞中通过PCR和反转录（RT–PCR）分析进行了重现，这些细胞被设计为在细胞中含有SF3B1K666N或SF3B1K700E内源性位点；在黑色素瘤细胞中有（MEL202）或没有（MEL270）自然发生的SF3B1R625G突变；在具有（Panc05.04）或不具有（Panc-1，Capan-2）自然发生的SF3B1K700E突变的胰腺癌细胞中（图1d）。这些事件的错误剪接在这些细胞系和患者样本中代表的不同SF3B1突变中是一致的。通过提取前100个和最后150个核苷酸，将每个内含子的长度减少到250个核苷酸（nt），并将每个内含子插入到记忆编码序列中的一个位置，该位置保留了内源性基因的5′ss和3′ss强度，同时生成大小相当的外显子。这些选择是由3′ss与5′ss的复杂性增加、SF3B1在3′ss识别中的作用以及外显子长度在剪接中的重要性决定的（图1e）。由此产生的载体可以通过流式细胞术定量评估突变依赖性蛋白的产生。将每个构建体转染到WT或SF3B1突变K562细胞中，并测量突变依赖性剪接和蛋白质产生。在六个最初合成的内含子中，三个具有突变依赖性的特异性（synMAP3K7i4-250、synTMEM14Ci1-250和synMTERFD3i1-250）（图1f，g），驱动了适度的突变依赖性蛋白质产生。突变依赖性蛋白质产生源于突变依赖性剪接变化。这些原理性研究证实了使用合成内含子进行突变依赖性基因表达的可行性。
接下来，作者测试了使用合成内含子实现癌细胞突变依赖性杀伤的治疗潜力。选择了单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-TK）系统，在该系统中，用更昔洛韦（GCV）处理HSV-TK表达细胞会产生细胞毒性代谢物。由于GCV是美国食品和药物管理局批准的抗病毒疗法，对缺乏HSV-TK的细胞具有低毒性，因此该系统对癌症基因治疗具有吸引力。将MTERFD3衍生的合成内含子插入HSV–TK编码序列（图2a），该内含子在SF3B1突变细胞中被更有效地切除。将这种分裂的HSV-TK序列或无内含子的HSV-TK克隆到慢病毒表达载体中，感染WT或SF3B1突变的K562细胞，选择阳性整合子并用GCV处理（图2b）。未转导的细胞表现出最小的活力损失，而用无内含子HSV-TK结构转导的细胞则快速死亡，与SF3B1突变状态无关。表达含有HSV-TK的合成内含子的SF3B1突变细胞表现出快速和剂量依赖性的活力丧失，与无内含子的HSV-TK引起的细胞活力丧失无法区分。相比之下，表达相同结构的WT细胞与未转化细胞的活力没有差异（图2c）。作者确定了五个分支点−32, −43, −48, −55和−61，富含胸腺嘧啶区域内的所有腺嘌呤。这个富含胸腺嘧啶的分支点区域之后是一个功能未知的富含嘌呤的区域（图2d）。由于内含子的复杂性，控制突变反应性的序列特征并不明显。因此，开发了一种大规模的平行剪接分析方法，以在合成内含子中映射和功能性询问序列特征。首先合成了一个由八个合成内含子组成的试验性迷你文库，其中七个内含子比母体合成内含子（synMTERFD3i1-250）短得多（长度为100–158nt），每个内含子对潜在的关键特征都有一个或多个扰动（图2e）。将这个小文库克隆到HSV–TK中，用慢病毒载体以低感染倍数将其导入WT或SF3B1突变的K562细胞，用GCV处理，并在处理6天后通过高通量测序基因组DNA中的整个内含子来测量每个构建体的相对损耗。这项实验演示了功能性询问的平行筛查（图2f）。接着通过将迷你文库中的单个构建物引入WT或SF3B1突变K562细胞并测量相对耗竭，证实了文库的准确性（图2g）。然后，测试了该方法对其他细胞类型的通用性。选择了WT和SF3B1K700E敲除MCF10A乳腺上皮细胞，以及T47D乳腺癌和MOLM-13 AML细胞，这些细胞被工程化以表达SF3B1WT或SF3B1K700E，它们重现了内源性基因的预期突变驱动的错误剪接。表达含有HSV–TK的合成内含子并施用GCV导致这些细胞类型中的每种细胞类型的强烈突变依赖性死亡（图2h），证实合成内含子能够针对多种细胞类型。在Panc05中也发现了类似的效果。胰腺癌细胞，与SF3B1-WT Panc-1细胞相比，具有自然发生的SF3B1K700E突变。在SF3B1突变细胞中，从HSV–TK premessenger RNA中有效地切除了合成内含子，但在SF3B1-WT细胞中没有，证实GCV敏感性来自突变依赖性剪接（图2i）。在表达影响其他RNA剪接因子（如SRSF2或U2AF1）的癌症相关热点突变的K562细胞中未观察到这种效应，强调了突变依赖性剪接的特异性。
反复删除每一个连续的100nt的synMTERFD3i1-250内含子表明，在保持突变反应性的同时，将原来的250nt合成内含子缩短到150nt需要保留前25个和最后125nt（图3a）。缩短到100nt需要保留前15个和最后85nt。与150个nt内含子相比，100个nt内含子表现出的突变反应性降低。虽然突变反应性进一步降低（图3b），但仍有可能缩短至75nt。典型剪接位点和隐匿剪接位点对突变依赖行为都是至关重要的，不能有大量干扰。在两种基因型中，在5′ss的10nt范围内发生单核苷酸突变的结构很少缺失，这表明5′ss的强烈一致性是内含子识别所必需的。在任何3′ss附近（内含子的最后26nt内）存在单核苷酸突变的构建体的突变反应性降低。相比之下，任何剪接位点远端的单核苷酸突变经常保持反应性（图3c）。突变反应性要求保持典型的3′ss略强于大多数内含子远端隐匿的3′ss；只要保持这种不平衡，剪接位点的强度就可以改变（图3d）。虽然内含子内部的单核苷酸突变通常是可以的，但随机改变该区域内的所有核苷酸则不是。这种内部随机结构通常在任何基因型中都没有表现出缺失（图3e）。作者的方法提供了对关键序列特征的高分辨率观察（图3f，g）。在5到50nt的窗口范围内进行的缺失扫描显示，隐性3′ss的缺失导致基因型非依赖性缺失，而大多数影响富含胸腺嘧啶、含分支点区域或相邻poly（A）序列的缺失消除了两种基因型的缺失。饱和突变显示内含子大多数结构保持良好的突变反应性（图3h）。最后，搜索了ss′和NT′之间可能的相互作用。对所有54个和1710个核苷酸对进行饱和突变，这些核苷酸对不会破坏5′ss和标准3′ss的GT或AG（图3i）。对于WT细胞，只有一个在3′ss处的相互作用达到了这个阈值。SF3B1突变细胞表现出更复杂的相互作用，尤其是在两个隐蔽的3′ss之间的位置，加强了该区域的复杂性。两种基因型在5′ss时均没有达到阈值。
接下来，将体外实验扩展到体内肿瘤，主要关注synMTERFD3i1-150。将荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP）构建物引入表达HSV-TK的WT或SF3B1突变K562细胞，这些细胞被synMTERFD3i1-150阻断，将这些细胞尾静脉注射到NOD scid IL2Rgnull（NSG）小鼠中，用PBS或GCV治疗，并通过实时成像监测白血病状况（图4a）。这两种基因型都形成了侵袭性白血病，迅速导致PBS治疗动物的致死性，与基因型无关。相反，GCV给药可立即持续抑制SF3B1突变型白血病，对WT白血病无影响（图4b，c）。GCV治疗导致存活率相应显著增加（图4d）。然后，将这些实验扩展到MOLM-13 AML模型。设计了MOLM-13细胞，以表达SF3B1WT或SF3B1K700E，以及荧光素酶GFP和HSV-TK，并被synMTERFD3i1-150阻断。通过尾静脉注射将这些细胞植入NSG小鼠体内，并在植入后第11天随机接受GCV或PBS治疗。仅GCV治疗植入SF3B1K700E表达细胞的小鼠，在统计学上有显著的存活和白血病抑制作用（图4e，f）。然后，评估了被synMTERFD3i1-150阻断的HSV-TK对Sf3b1突变体和WT造血干细胞和祖细胞混合群体的治疗效果和特异性。为了实现这一点，使用从内源性Sf3b1基因座表达Sf3b1K700E的基因工程条件敲除小鼠（Mx1-cre Sf3b1K700E/WT小鼠）。在这些动物中，造血细胞由同源细胞表面标记物CD45标记。然后，用表达GFP和HSV-TK的慢病毒载体感染来自Sf3b1K700E突变小鼠和WT小鼠的混合群体，其中HSV-TK的表达由synMTERFD3i1-150调节。通过增加GCV浓度在体外处理这些细胞，可以追踪不同Sf3b1突变体和WT造血细胞中的GFP+细胞。GCV治疗在这种混合人群中导致Sf3b1突变细胞的耗竭，而不是WT造血细胞的耗竭（图4g，h）。当小鼠植入含或不含Sf3b1K700E的造血前体细胞，体内GCV治疗仅影响含Sf3b1K700E的造血细胞时，也可以看到类似的结果。GCV治疗在外周血和BM中抑制Sf3b1突变细胞的效果很明显，HSV–TK合成内含子结构几乎可以根除BM中的Sf3b1突变细胞。
为了评估SF3B1突变在体内是否能达到类似的肿瘤抑制效果，在SF3B1突变乳腺癌和黑色素瘤模型中测试了合成内含子调节的HSV–TK。将被synMTERFD3i1-150阻断的HSV-TK导入人雌激素受体阳性的T47D乳腺癌细胞，并且将这些细胞植入雌性NSG小鼠（图5a）。然后从第7天开始随机给小鼠注射GCV或PBS。与上述白血病模型一样，当给动物注射GCV时，仅在表达SF3B1K700E的肿瘤中观察到生长抑制（图5b）。接下来，测试了合成内含子调节的HSV–TK表达对自然发生SF3B1R625G突变（MEL202）或无SF3B1突变（MEL285）的黑色素瘤细胞体内生长的影响。虽然GCV治疗对SF3B1-WT MEL285细胞的肿瘤生长或存活没有影响，但当使用GCV治疗时，植入SF3B1突变MEL202细胞的小鼠经历了强烈的肿瘤生长抑制并提高了存活率（图5c，d）。接下来，评估了将合成内含子调节的治疗结构传递给携带已建立的SF3B1突变的动物的治疗效果。为此，将200万个MEL202细胞（SF3B1R625G）植入NSG小鼠的两侧。在第5天可见肿瘤形成时，小鼠随机接受GCV或PBS治疗。在第5-7天和第18-20天通过直接瘤内注射将编码HSV-TK的慢病毒颗粒通过Synmterfd31-150-v6700阻断，同时输送给所有小鼠。尽管所有小鼠都接受了HSV-TK结构，但只有那些同样接受GCV的小鼠肿瘤才减小（图5e，f）。RT-PCR分析显示了肿瘤组织中合成内含子结构的表达，证实通过慢病毒瘤内直接注射进行细胞传递。HSV–TK mRNA在非肿瘤组织中几乎不存在，这与体内局部给药后WT细胞没有偏离靶点的效应一致（图5g）。
合成内含子可用于实现多种抗癌突变依赖性表达，如细胞因子、趋化因子和细胞表面蛋白，对健康细胞的影响可能很小。肿瘤模型的持续发展将有助于对非肿瘤组织的治疗效果和效果进行严格的测试，尤其是对于剪接体突变特别常见的髓系恶性肿瘤和非皮肤性黑色素瘤。作者合成的含有荧光报告的内含子（图1）可用于筛选抑制RNA剪接中癌症特异性改变的基因和化合物。最后，作者的研究阐明了大规模平行分析对剪接功能询问的作用，包括推导出控制突变依赖性剪接的合理规则，这将有助于这些和其他合成内含子的设计和改进。
教授介绍
Omar Abdel Wahab教授是人类肿瘤学和发病机制计划（HOPP）的成员，也是斯隆凯特琳纪念癌症中心医学部的副主治医师。Abdel Wahab博士的研究重点是基因组改变在造血系统恶性肿瘤发病机制中的作用。Abdel Wahab实验室专注于理解和定位导致血液系统恶性肿瘤的体细胞突变。鉴于在白血病和淋巴瘤中编码转录调节因子的基因中经常发现体细胞突变，Abdel Wahab特别关注了解剪接体蛋白和表观遗传调节因子突变在血液恶性肿瘤中的功能。实验室目前的几个研究领域包括：剪接体蛋白突变在骨髓增生异常综合征和慢性淋巴细胞白血病中的作用；选择性靶向剪接体突变癌的治疗方法；慢性淋巴细胞白血病的表观基因组特征等。
参考文献
North K, Benbarche S, Liu B, et al. Synthetic introns enable splicingfactor mutation-dependent targeting of cancer cells. Nat Biotechnol.2022;10.1038/s41587-022-01224-2. doi:10.1038/s41587-022-01224-2