2022-05-16

Science | ESCRT介导的膜修复保护肿瘤源性细胞免受T细胞攻击

原创 榴莲不酥 图灵基因 2022-05-16 10:17

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：榴莲不酥

IF=47.728

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

穿孔素释放后，转运蛋白所需的内体分拣复合物（ESCRT蛋白）在靶细胞中被精确地招募到细胞毒性T淋巴细胞（CTL）结合位点。抑制癌源性细胞中的ESCRT机制增强了它们对CTL介导的杀伤的易感性，ESCRT机制对穿孔素孔的修复限制了颗粒酶进入胞浆，有可能使靶细胞抵抗细胞溶解攻击。

 

2022年4月22日，在Science杂志上发表了一篇名为“ESCRT-mediated membrane repair protects tumor-derived cells against T cell attack”的文章，描述了ESCRT蛋白参与小膜创伤的修复，限制靶细胞溶胶对CTL分泌的颗粒酶的可及性，从而促进癌源性细胞在细胞溶解攻击下的存活。

 

CTL和自然杀伤细胞通过极性释放穿孔素和颗粒酶杀死病毒感染的细胞和肿瘤细胞。穿孔素是一种成孔毒素，在靶细胞的质膜上造成损伤，颗粒酶通过它进入胞质溶胶并启动细胞凋亡。转运蛋白所需的ESCRT参与小膜创伤的修复。细胞毒性淋巴细胞，包括CTL和NK细胞，负责识别和破坏病毒感染或致瘤细胞。为了杀死它们的靶细胞，CTL和NK细胞分泌一种叫做穿孔素的成孔毒素，通过这种毒素，诱导凋亡的丝氨酸蛋白酶（颗粒酶）被直接输送到细胞质中。运输所需的ESCRT蛋白质可以修复由细菌成孔毒素、机械损伤和激光消融引起的小伤口和质膜孔隙。ESCRT依赖的膜修复与坏死性下垂和热下垂期间内孔介导的质膜损伤的再密封有关。

为了研究ESCRT介导的膜修复是否可能参与T细胞杀伤过程中穿孔素孔的去除，研究团队首先确定了癌源性细胞中的ESCRT蛋白是否在穿孔素分泌后被招募到CTL结合位点。他们使用了来自OT-I小鼠的CTL，该小鼠表达一种高亲和力T细胞受体（TCR）。对OT-I CTL进行活细胞显微镜观察，这些CTL与表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的Tsg101或Chmp4b的SIINFEKL脉冲靶细胞结合，这两种ESCRT蛋白与膜修复有关。为了及时将ESCRT蛋白的招募与穿孔素暴露相关联，也监测了高浓度碘化丙啶（PI）培养基中的CTL-靶相互作用。在PI内流后30-60s内，EGFP标记的ESCRT蛋白始终被招募到CTL结合位点。值得注意的是，含有ESCRT的材料，可能是膜碎片，经常从靶细胞分离并粘附在CTL表面。在约60%的结合物中观察到这种现象，其中靶点表达EGFP-Tsg101或EGFP-Chmp4b。激光诱导质膜损伤后，细胞修复后ESCRT阳性膜脱落。从靶细胞脱落到突触间隙的质膜碎片可能含有CTL受体的配体。靶细胞死亡会分离CTL和靶细胞，在CTL表面显示靶细胞衍生物质。图1：靶区荧光标记的ESCRT蛋白定位于穿孔素分泌后CTL杀伤部位

研究团队捕获了四个各向同性3D 8-nm分辨率的EM数据集，这些数据集显示了在分泌溶解颗粒内容物后瞬间CTL杀死癌细胞。对T细胞的细胞膜、细胞核、溶解颗粒、高尔基体、线粒体和中心体进行半自动分割，可以更容易地可视化和分析3D EM数据。分段数据的重建视图清楚地表明中心体、高尔基体和溶解颗粒向IS的极化，所有这些都是CTL杀伤的标志。检查突触后靶细胞的表面拓扑结构以确定某些膜是否细胞间隙内的物质也可能来自靶细胞，注意到靶细胞膜的多个管状和芽状突起延伸到突触空间；因此至少一些观察到的膜结构仍与靶细胞保持连续性。ESCRT蛋白已被证明在质膜修复的情况下产生出芽结构。图2：CTL靶结合物的8 nm分辨率3D FIB-SEM成像

为了将靶向衍生的ESCRT蛋白质定位到IS的高分辨率景观上，研究团队捕获了三个FIB-SEM数据集，这些数据集具有与mEmerald-Chmp4b定位相关的3D cryo-SIM荧光数据。这种相关的光学和电子显微镜（CLEM）显示靶细胞中表达的mEmerald-Chmp4b特异性地重新聚集到靶细胞质膜上，与分泌的IM相对应。ESCRT募集部位的质膜地形明显改变，显示出许多芽状突起。mEmerald-Chmp4b荧光也与细胞间突触空间中的一些结构重叠。总之，活细胞成像和3D cryo-SIM和FIB-SEM CLEM证明了ESCRT蛋白在突触上的定位，突触是CTL杀伤的最终部位，因此在空间和时间上与穿孔素分泌相关。这些数据表明ESCRT复合物参与了穿孔素孔的修复。图3：相关3D cryo-SIM和FIB-SEM显示靶源性ESCRT在溶细胞IS内的定位

研究团队接下来直接测试了当靶细胞同时暴露于重组穿孔素（Prf）和颗粒酶B（GZMB）时ESCRT抑制的效果。在高浓度下单独使用Prf可以裂解细胞，因此首先确定了亚裂解Prf浓度，该浓度将暂时渗透质膜，但允许细胞恢复。将表达VPS4aWT（野生型，WT）或VPS4aE228Q的B16-F10细胞暴露于含有PI的一系列Prf浓度下，并使用流式细胞术评估细胞活力和PI摄取。表达显性阴性VPS4a E228Q的细胞比ESCRT活性细胞对Prf更敏感。质膜重新密封的延迟可以解释这种差异。因此推断延迟穿孔素孔重排也可能增加GZMB进入靶细胞的摄取。当通过膜联蛋白V染色测定细胞死亡时，ESCRT抑制的细胞对复合穿孔素GZMB更敏感。当用小鼠淋巴瘤癌细胞系重复这些实验时，也观察到类似的结果。ESCRT抑制的靶细胞对CTL分泌和Prf GZMB更敏感的观察支持了ESCRT通路有助于Prf暴露后膜修复的假设。图4：ESCRT抑制可增强癌细胞对CTL杀伤和重组裂解蛋白的敏感性

逃避细胞死亡是癌症的标志之一，而研究团队的实验结果表明，ESCRT介导的穿孔素孔膜修复可能会限制靶细胞溶胶对CTL分泌的颗粒酶的可及性，从而促进癌源性细胞在细胞溶解攻击下的存活。尽管其他因素可能有助于设定靶向杀伤敏感性的阈值，但现在必须将积极修复毛孔中的穿孔素孔膜视为一个明确的促发因素。

教授介绍

Mellman 博士是基因泰克癌症免疫学副总裁，耶鲁大学医学院细胞生物学和免疫生物学Sterling教授、路德维希研究所成员和耶鲁大学癌症中心科学主任。他是美国国家科学院、美国艺术与科学院和EMBO的成员。Mellman博士的实验室以细胞生物学的进步以及将这些见解应用于理解免疫反应而闻名。他的团队将基因泰克的Tecentriq®（atezolizumab）带到了临床，并监督了iNeST-RNA、tiragoluma、cobimetinib、mosunetuzumab和ipatasertib的发现和开发。最近的奖项包括耶鲁大学的WilburCross奖章和AAPM颁发的2019年癌症免疫学领导奖。

参考文献

Ritter AT, Shtengel G, Xu CS, et al. ESCRT-mediatedmembrane repair protects tumor-derived cells against T cell attack. Science.2022 Apr 22;376(6591):377-382. doi: 10.1126/science.abl3855. Epub 2022 Apr 21.PMID: 35446649.