异养硝化特性及研究进展
引言
随着工农业生产的快速发展, 氮肥的使用量逐年增加，过程中氮损失量达到27%-60%。氮损失是氮循环失衡的表现之一，会导致土壤肥力下降、水体富营养化、温室气体排放等一系列环境问题[1]。
亚硝酸氧化细菌催化硝化过程中的第二步，将亚硝酸盐转化为可被众多植物与微生物利用的硝酸盐，是氮循环与生物脱氮的重要一环[1, 2]。传统认为自养亚硝酸氧化细菌是自然界中硝化反应的主要承担者，但近年来的众多研究表明相较于自养亚硝酸氧化细菌，异养亚硝酸氧化细菌具有对环境的高适应力，更高的硝化效率，更短的培养时间等优势。然而仍有大量的异养亚硝酸氧化细菌处于未培养的状态并且对其的研究有限。此外，在目前的生物脱氮中，硝化过程的稳定性仍然是限制脱氮效果的主要因素。因此，更深入地研究硝化机制与特性对改进现有脱氮工艺有着重要意义。本文就异养亚硝酸氧化细菌的脱氮特性进行综述，并阐述了目前的研究现状与挑战。
1. 异养亚硝酸氧化菌的发现
硝化作用包括氨氧化古菌、氨氧化细菌介导的氨氧化与亚硝酸氧化细菌介导的亚硝酸氧化两个过程[3]。由于多种因素，对异养亚硝酸氧化细菌的研究长期滞于其他参与氮循环的微生物[4]，但随着近年来检测手段的进步，异养亚硝酸氧化细菌在氮循环中的作用逐渐得到重视。此外，异养亚硝酸氧化细菌在添加外部碳源的情况下易成为优势菌、相对自养亚硝酸氧化细菌培养周期更短与能适应多种环境的优点，也使得异养亚硝酸氧化细菌在生物脱氮中应用广泛[5, 6]。
目前已从土壤、淡水、海水与高盐水体、热泉等多种环境中[7, 8]发现了众多展示出新特性的高效异养硝化菌，如以H2 、甲酸盐与硫化物等为代谢底物[8]或对极端条件的适应性[9]。这些亚硝酸氧化细菌分别属于Nitrobacter，Nitrotoga，Nitrococcus，Nitrospira，Nitrospina，Nitrolacea[10]和近年发现的“Candidatus Nitromaritima”[7]七类。其中的一部分罗列在表1：
表1 一些异养硝化菌的特性
Table 1 Nitrogen removal characteristics of some heterotrophic nitrification bacteria
菌株
Strains 来源
Source 特性
Features 亚硝态氮去除率
Nitrite nitrogen removal efficiency（%） 参考文献
Reference
Pseudomonas M-11 淡水底泥 耐低温 93 [11]
Pseudomonas Y3 海洋沉积层 耐高盐 98.69 [12]
Pseudomonas YL 污水处理器 同步反硝化 92.7 [13]
Nitrospira inopinata 油井 全程硝化 100 [14]
Klebsiella y6 海水 高COD去除率 99.20 [15]
Bacillus SLWX2 海水 高盐耐性 99.5 [16]
Nitrotoga fabula KNB 活性底泥 多供能代谢 /
[8]
Nitrotoga sp.AM1 沿海泥沙 耐低温 / [17]
Nitrococcus mobilis Nb-231 海洋 氧化硫化物 / [5]
Nitrospina watsonii sp. nov. 浅海 耐低溶解氧 / [18]
Nitromaritima RS 深海 耐盐、高温 / [7]
2. 硝化代谢途径
硝化作用是由一系列酶分步催化的。第一步（氨经氧化转化为羟胺）通过氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，Amo）进行；第二步（羟胺转化为亚硝酸盐）分两步进行：首先，羟胺氧化还原酶（Hydroxylamine oxidoreductase，HAO）将羟胺转化为一氧化氮，之后另一种迄今未知的酶或者O2将一氧化氮转化为亚硝酸盐；第三步亚硝酸盐到硝酸盐的转化通常在亚硝酸氧化细菌中完成；亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，Nir）与呼吸型硝酸还原酶（Respiratory nitrate reductase，Nar）是通过反硝化途径补充氮库的重要一环[19]。
图1 氮代谢途径与过程关键酶
Figure 1 Proposed nitrogen metabolic pathway and key enzymes
异养硝化菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶是亚硝酸氧化还原酶（nitrite oxidoreductase，Nxr）。Nxr每氧化一分子亚硝酸盐就将2个电子转移至电子传递链中。在Nitrobacter中，Nxr是一个含有Fe-S中心的钼蛋白，位于细胞膜内侧以及胞浆内膜（intracytoplasmic membranes，ICM）上[20]。Nxr催化的亚硝酸盐反应是可逆的，所以Nxr也能从有机化合物中获得电子以还原硝酸盐。目前已知NXR由2个α（NxrA）亚基，2个β（NxrB）亚基以及1个γ（NxrC）亚基组成，其中α亚基含有能与底物结合的钼蝶呤辅因子，β亚基和γ亚基分别含有传递电子的Fe-S中心与血红素 [21]。Nxr催化的亚硝酸氧化反应在一定条件下具有可逆性，迄今已发现众多同步硝化反硝化的异养亚硝酸氧化菌[12, 15]。
不同于Nitrobacter，在Nitrospira moscoviensis 中，Nxr的α亚基位于细胞膜外侧[6]。这种Nxr的朝向差异可能揭示了不同种属的异养亚硝酸氧化细菌对低浓度亚硝酸盐的适应力，同时也表明功能趋同的亚硝酸氧化细菌可能有着多种进化途径，包括不同微生物之间的基因转移[22]。最初发现Nitrospira内Nxr有四个组成部分，其中两个组分分别与Nitrobacter的α与β亚基有很高的同源性，另两个未知[23]，但是就Nxr的两亚基的编码基因而言，不同种属硝化菌之间nxrB的差异远大于nxrA[24]。这种功能基因上的进化多样性为以nxrB为功能性分子标记结合宏基因组学技术高效地分析环境中的硝化微生物提供了可能性。
3. 亚硝酸氧化影响因素
影响异养硝化特性的理化因素众多，其中研究较多的是pH、温度、溶解氧（DO）、C/N等。
3.1. pH对硝化特性的影响
迄今为止，关于pH对硝化作用的影响仍未达成一致的认识。因为其具有对中性至偏碱性pH的偏好性，传统认为中性或微碱性环境适于大多数硝化菌生长繁殖[25]。Zhang等[26]通过响应面优化法发现N. Winogradskyi的最适培养pH为7.83。尽管有学者认为酸性土壤环境中未存在显著的硝化反应迹象[27]，然而也有研究表明在pH 3.0的土壤中存在不弱于中性土壤的硝化作用[28]。
游离氨能抑制异养硝化细菌的硝化活性[29]，而环境中（如水体、土壤或培养基等）pH的改变能促使游离氨溶解状态的变化。Poot等[29]的研究显示，硝化颗粒表面与中心0.4的pH差，导致了颗粒由外侧到内侧递减的NH4+浓度分布，而较高的NH4+浓度提高了表面氨氧化细菌的硝化效率，颗粒中心的低NH4+减少了对亚硝酸氧化细菌的抑制作用。刘灵婕[30]等发现FA对氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌菌群的临界抑制浓度分别为8.1 mg·L-1和6.6 mg·L-1，表明亚硝酸氧化细菌相对于氨氧化细菌菌群对游离氨更敏感。而对Nitrospira和Nitrotoga共存的生物膜反应器进行群落分析发现，弱酸性pH与较低温度相结合更有利于后者的生长[31]。这些研究不仅对研究亚硝酸氧化细菌硝化机制有重要意义，也为脱氮工艺的改进提供了参考。
3.2. 温度对硝化特性的影响
温度对亚硝酸氧化作用的最大速率（Kmax）和硝化率（%）有着显著影响。大多数异养硝化微生物最适培养温度为28～37℃[26, 32]，同时在最适温度范围内，硝化率与硝化最大速率随温度的升高而增加[33]。在氧气充足的情况下，Janthinobacterium sp. M-11能在2℃的温度下达到98%的脱氮率，当温度提升至25℃时，脱氮效率达到最大值，而当温度提升至35℃时，脱氮效率下降了60%[11]。另一方面，亚硝酸氧化细菌也能适应最高达63℃的高温[34]。Ngugi等[7]在温度高达52℃的深海中发现与Nitrospina高度分化的亚硝酸氧化细菌群落，命名为Candidatus Nitromaritima RS。类似的，Sorokin等[35]Nitrolancea hollandica gen. nov., sp. nov.能在最高46℃的条件下保持硝化活性，且在40℃时达到最大硝化率。
3.3. C/N对硝化特性的影响
大多数异养硝化细菌的最适C/N在6~20之间，但也有例外，如贫营养菌Janthinobacterium sp. M-11[11]在C/N为5的条件下达到98%的脱氮率。其次，低COD添加量能有效抑制亚硝酸氧化细菌的活性。有研究表明[36]通过降低进水C/N至0.88从而抑制异养细菌的繁殖，从而实现COD（≤75％）和氮（≤85％）的高去除效率。Zhang等[37]控制五组在完全相同的条件下操作的MBR的进水C/N分别为0，0.5，1.0，2.0和4.0，结果表明当C/N低于1.0时，Nitrobacter和Nitrospira的生物活性和生物多样性均随着COD的增加而降低，反之大量COD添加（C/N比率高于1.0）会导致CANON反应器中的亚硝酸盐积累，进而提高了NOB的活性。
3.4. 盐度对硝化特性的影响
盐度是影响硝化作用的重要因素。即使是从海洋环境中分离出的硝化菌株也受到高盐条件的抑制[38, 39]。当以较低的 NaCl浓度（5 g/L）进行长期培养，亚硝酸氧化细菌的硝化速率也无法回复到对照水平[40]。此外，Gonzalez-Silva等[38]比较了NaCl浓度在0, 13, 22 与33 ‰时，不同MBBR反应器内硝化菌群与硝化反应的变化，发现随着盐度的增加，海水反应器的硝化率较淡水反应器下降更慢，说明相较于氨氧化细菌、氨氧化古菌，亚硝酸氧化细菌对盐度更敏感。相反地，也有部分研究显示，亚硝酸氧化细菌可以对盐度胁迫产生高抗性。郭姿璇[41]等对取自SBR反应器中的活性污泥进行盐度驯化，发现NaCl浓度为15 g/L时，氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率的活性系数分别下降至46%和1%。除了David等[7]在11.2%盐度条件下发现类似Nitrospina的亚硝酸氧化细菌之外，Halomonas sp[42]能在NaCl浓度为60 g/L的条件下稳定地进行同步硝化反硝化反应。此类抗性机制可能来源于自体合成的肌酸、羟外嘌呤或蛋白的保护作用[7]。
盐度还能影响亚硝酸氧化细菌的高温抗性。在Courtens等[43]在嗜温硝化底泥的实验中，发现在5 g/L NaCl连续培养的条件下，亚硝酸氧化细菌能在50℃的高温下保持一部分硝化活性，而对照组在47.5 ℃则失活。Quan [44]等认为尽管高浓度NaCl对膜反应器上的亚硝酸氧化细菌与DB有显著的抑制作用，但将盐度控制在20 g/L以下可以保持原有的70%脱氮效率。此外，盐度能影响氧气在水中的最大溶解度以及氧气的直接转化率，导致水中溶解氧（Dissolved oxygen，DO）浓度降低[45]，从而对硝化作用产生联合影响。
3.5. 溶解氧对硝化特性的影响
大多数异养硝化细菌都是好氧微生物，从而使得DO成为影响微生物代谢的一个关键因素[46]。首先，不同亚硝酸氧化细菌对DO的需求存在差异。Liu等 [47] 在0.37与0.16 mg/L DO条件下，对含氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌的硝化底泥分别进行短期（10天）与长期（40天）培养，在总体硝化率并无显著差异的情况下，底泥中的亚硝酸氧化优势菌由Nitrobacter转变为Nitropira。Wang[48]等发现随着DO的升高反硝化作用被逐渐抑制，同时在亚硝酸氧化优势菌为Nitrosomona、DO为2.5 mg/L时反应器达到最大脱氮率84.12%。
对于包含氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌的硝化底泥，低DO能增加微生物多样性[48]。Ca. Nitromaritima编码能在低DO浓度下运行的电子传递链[7]，这可能是其对低DO的适应机制之一。Meng等[36]发现在不同C/N下，DO是影响氨氧化细菌，亚硝酸氧化细菌与其它异养细菌相互竞争的限制性因素。另一方面，也有研究表明，在氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌共培养情况下，高DO有利于富集亚硝酸氧化细菌，而对于只含亚硝酸氧化细菌的底泥，DO变化对微生物多样性没有明显影响[49]。鉴于亚硝酸氧化以氧气为电子受体，推断这种情况可能与亚硝酸氧化细菌与氨氧化细菌对氧的竞争有关。
表2 一些异养亚硝酸氧化菌的脱氮特性
Table 1 Nitrogen removal characteristics of some heterotrophic nitrification bacteria
菌种
Strains 来源
Source 碳源
Carbon Source 碳氮比
C/N 酸碱度
pH 温度
Temperature（℃） 参考文献
Reference
Klebsiella sp. Y6 海底沉积物 柠檬酸钠 17 7.0 30 [15]
Rhizobium sp. ZB61 填埋场渗滤液 葡萄糖 8 7.0 30 [50]
Halomonas sp. X3 鱼类养殖场 葡萄糖 10 8.5 28 [42]
Klebsiella sp. Y5 海底沉积物 柠檬酸钠 17 7.0 28 [51]
Pseudomonas aeruginosa YL 反应器 琥珀酸钠 10 7.0 30 [13]
Acinetobacter pittii A14 水库 乙酸钠 12 7.0 30 [52]
Candidatus Nitrotoga fabula 反应器 / / 7.8 37 [8]
Nitrotoga sp. AM1 海岸沙土 碳酸氢钠 3 7.8 16 [53]
Acinetobacter sp. Sxf14 微污染水库 乙酸钠 8 7.11 20 [54]
Vibrio diabolicus SF16 海洋沉积物 乙酸钠 10 7.5~9.5 [55]
4. 未培养硝化菌的应用研究
由于多种因素，例如营养缺陷而在自然界中丰度低或是微生物间复杂的相互作用等，大量可进行硝化作用的微生物仍处于未培养状态[56]。现阶段对该类未培养硝化微生物的可培养研究主要集中在对培养基与培养条件的优化以及通过硝化反应器对常规富集培养方法进行改善。Park等[57]通过维持SBR反应器中的亚硝酸盐浓度与DO在较低水平，筛选并分离得到一株高效的硝化菌Nitrospira sp.。Lucker, S.等通过筛选来自20个来自污水处理厂并含有Nitrotoga与Nitrospira的活性污泥样品，发现低温是形成高Nitrotoga丰度（2％）的主要因素[58]。Fujitani等[39]经过长期的低温培养，成功富集并分离得到难培养菌Candidatus Nitrotoga arctica AM1并发现其在16℃时有着最高的硝化速率。此外，由于异养亚硝酸氧化细菌对温度变化的适应能力，在实际生产中可以通过阶梯式逐步升温或降温处理，针对性地培养在特定温度下能稳定运行的硝化菌群[59]。
近年来兴起的宏基因组学等技术与反应器培养结合极大地便利了对环境中未培养微生物的多样性、群落结构、进化关系与微生物—环境互作等的研究。在PNA中，亚硝酸氧化细菌的亚硝化活动会在很大程度上降低脱氮效率，Persson等[60]采用逐步降低底物NH4+浓度与DO值的运行方式，通过宏基因组测序与16S rRNA结合的方法首次在PNA中检测到Nitrotoga的存在。Ngugi等[61]通过宏基因组测序发现在DO含量极低（≈0.3~5 μM）、较高盐度（11.2%）、高温（52℃）条件下的红海底部的卤水-海水交界处Nitrospina构成了16S rRNA的1/3以上。近年来全程硝化菌逐渐被认识，但环境中全程硝化活性的检测仍是一个难题，这是因为迄今所发现的全程硝化菌与亚硝酸氧化菌Nitrospira的16S rRNA，nxrA与nxrB有很高的同源性。Holger等[22]利用功能基因nxrB与AmoA为目的片段，结合FISH技术构建了全程硝化菌Candidatus Nitrospira inopinata的进化关系。Yu等[62]利用NCBI Genebank与IMG（Integrated Microbial Genomes）databases建立了全程硝化菌A簇、B簇与氨氧化细菌的amoA序列库，并设计了一系列全程硝化菌A簇的amoA基因引物并结合宏基因组学与宏转录组学技术分析了6个环境样本（湖泊、河流、潮滩、河湾、海滩与生物反应器）中的全程硝化菌的多样性，发现氨氧化古菌、β-氨氧化细菌与全程硝化菌Nitrospira的丰度与环境因素如盐度，亚硝酸盐浓度、pH等无显著相关性，而与游离氨浓度呈正相关。Pinto等[63]结合蛋白质组学与16S rRNA等技术在饮用水滤膜上检测到了全程硝化菌Nitrospira。通过类似的方法，Cai等[64]在Nitrobacter-like 亚硝酸氧化细菌群落中检测到编码将氰酸盐分解为NH3与HCO3-的水解酶基因。此外，Fujitani等[17]发现Candidatus Nitrotoga arctica AM1不受高浓度氨抑制。以上研究表明，推断环境中即使是较低丰度的亚硝酸氧化细菌如Nitrotoga[65, 66]很可能与氨氧化细菌存在共生关系，从而在硝化反应中起到重要作用。Cai等[64]进一步的研究表明，在共培养条件下，氨氧化细菌对NH4+有着更高的Ks值，表明在低NH4+浓度条件下实现稳定脱氮的可能，这种底物动力学上的变化与共培养的代谢特征为含氮污水的处理提供了新的思路。
5. 结论
目前关于异养硝化菌的研究已经很多，研究范围与研究层次也在不断扩大与深入，但仍然面临着一些问题与挑战：
（1） 应该如何讨论多种影响因素对异养亚硝酸氧化细菌的联合作用？如何将这转化到实际生产中，以期改进现有脱氮工艺或发展联合脱氮的新技术？
（2） 异养亚硝酸氧化细菌在废水处理过程中很难保持稳定的活性，考虑到多种理化因素对异养亚硝酸氧化细菌的作用，如何在通过控制这些参数实现培养在特定条件下能稳定运行的活性污泥系统？
（3） 如何利用高通量测序等分子生物学手段特异性检测硝化菌群中的亚硝酸氧化细菌？对于难培养亚硝酸氧化细菌应如何改进培养方案与分离策略以期高效地获得纯培养菌株？
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