一文读懂Ka/Ks

什么是Ka/Ks

The ratio of the number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site (Ka) to the number of synonymous substitutions per synonymous site (Ks)。

Ka/Ks表示非同义替换位点替换次数(Ka)与同义替换位点替换次数(Ks)的比值。

没听懂，再说一遍？

首先，假如你正在比对两个物种的一对同源基因序列。进化的力量通常使得这两条DNA序列有些差异。我们都知道密码子有简并性的特性，因此有的差异会导致翻译出不同的氨基酸（非同义突变，nonsynonymous changes），有的因为同义密码子的存在产生了相同的氨基酸（同义突变，synonymous changes）。统计出这两条序列之间发生的非同义与同义替换的所有次数，我们就可以观察到序列的变化情况了。接下来就是对数据做些调整了。

我已经明白了，现在有了序列的进化情况，为什么还要做调整？

由于密码子的简并性，我们的序列中大概只有25%是同义突变的。假设基因并没有受到选择，也就是发生的是中性进化，基因的任何一个突变从稀有变成共有的机会是相同的，并不受其它外界因素的影响。大多数的突变的消失都是随机的，但是我们假设种群大小是N，一个等位基因刚刚通过突变而出现在种群中，那么它在2N个等位基因的种群中固定的可能性是p=1/(2N)（详见遗传漂变）。在上面的例子中，每一个突变被固定的概率是一样的，那么发生非同义突变的可能性与发生同义突变的可能性也是一样的。所以，在中性进化的背景下，如果我们对密码子的简并性进行矫正后，就应该有一种方法得出非同义突变的次数等于同义突变的次数，即Ka/Ks=1。因为Ks可以告诉我们进化的背景速度，因此偏离1的比例将告诉我们作用于蛋白上面的选择情况。

听起来是不是很简单？

很遗憾，并不是的。举个栗子，对于编码天冬氨酸和赖氨酸的密码子：他们都起始于AA，赖氨酸结束于A或者G，天冬氨酸结束于T或者C。所以如果C突变成T的机率大于C突变成A或G（通常就是这样子滴），那么第三个位置上的突变更可能是同义突变。因此许多计算Ka/Ks的方法，考虑到这部分因素，使用了的不同的转换模型，也会使得最后的Ka/Ks值有些不同。

需要考虑两个物种分离后的时间吗？

好问题！由于序列随着时间会不断的变化，因此我们观察到的变化次数可能小于实际发生的变化次数。如果一个碱基最开始是A，在一个分支中，他被替换成了C，然后又被替换成了T，然后在我们的比对结果上面只能看到一次替换。同样，可能我们看到的完全比对上位点，也可能已经替换了很多次，只不过最后变成了原来的碱基。幸运的是，实际的分歧程度可以从观察到的总的分歧程度来估算。然而，没有人能完美的解决这个问题：随着变化数量的增加，来自于对齐序列的那部分信息将会减少，并逐渐接近于饱和，在这种情况下数据是没用的，得到的结果也是不准确的。因此计算Ka/Ks时，遗传距离较近的序列往往得到的结果更准确。

OK，我已经得到了Ka和Ks值，然后呢？

Well，你现在已经有了表征蛋白进化次数的值（Ka）。假设进化选择并不出现在silent site（发生同义突变可能性很低的位点），从进化的中性理论来看，Ks值应该与基因的突变率成正比。这是因为，假设μ是每代的中性突变率，虽然新的中性突变进入固定的概率是1 / 2N，但是它们以2Nμ的速率每代产生，因此中性进化的速率应该是2Nμ/2N = μ，这个值就是Ka所表征的。如果这样去计算，那么Ka与Ks的比值也告诉了我们基因进化的方式。从图中，我们发现通常Ka是小于Ks。因为改变蛋白质的突变在两个物种之间的差异远小于沉默的物种。也就是说，在大多数的情况下，选择消除了有害突变，并保持蛋白质不变（即纯化选择，purifyingselection）。

在少数情况下（通常当免疫系统基因与寄生虫共同进化时），我们发现Ka远大于Ks（即Ka / Ks >> 1）。这是有力的证据表明选择已经改变了蛋白质（正向选择，positive selection）。

我明白了，如果Ka等于Ks，那么序列的进化肯定是中性的？

没那么简单。中性进化是一种不可排除的可能性。但是，如果该基因的一部分（例如一个蛋白质结构域）处于正选择状态，而其他部分处于净化选择范围内，那么你也会得到Ka/Ks等于1的结果。不过，也有很多方法可以容许进行多序列比对之后，通过考虑物种的系统发育，计算出序列中每个codon的Ka/Ks（位点模型）。另外，可以检测基因在一个谱系中是否存在不同的比率，这表明该物种特有的事情发生了（分支模型）。这些分析方法能揭示出更多的正向选择，提供了更多的分析方向。

该怎么把我的序列比对结果转化成Ka/Ks值呢？

现在已经有很多种不同的方法供我们选择，最常用最方便的是MEGA。当然老牌的杨子恒老师的PAML也同样十分优秀。Hyphy软件除了提供全局的Ka/Ks计算外，也支持分支位点等各种模型，不过我比较喜欢Hyphy的一点是可以多线程计算。这些软件的使用方法我会在之后的推送中具体给出。