转录组数据分析——原始数据质量控制（QC）

获得转录组数据（.fastq文件）后的第一步就是对原始数据的质量控制。

目的

质量控制的目的是全面查看原始数据的质量，内容包括碱基质量评估、GC含量检验、N碱基数量评估、TCGA碱基分布、k-mer数量检验等。

方法

可以于检验fastq文件质量的软件有很多，例如FastQC、fastp、multiQC等。本文主要介绍应用最多的FastQC。

FastQC是一款基于Java的软件，须在linux环境下使用命令行运行，它可以快速多线程地对测序数据进行质量评估（Quality Control），其官网地址为：Babraham Bioinformatics。

安装

FastQC可以使用conda进行安装。在linux环境下运行命令conda install fastqc即可，运行结果如下图。

Fig.1

运行命令fastqc -h可检验其是否成功安装，运行结果如下图。

Fig.2

运行

# 运行命令的基本格式

# fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN

# 主要是包括前面的各种选项和最后面的可以加入N个文件
# -o --outdir FastQC生成的报告文件的储存路径，生成的报告的文件名是根据输入来定的
# --extract 生成的报告默认会打包成1个压缩文件，使用这个参数是让程序不打包
# -t --threads 选择程序运行的线程数，每个线程会占用250MB内存，越多越快咯
# -c --contaminants 污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name [Tab] Sequence，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析，一般用不到
# -a --adapters 也是输入一个文件，文件的格式Name [Tab] Sequence，储存的是测序的adpater序列信息，如果不输入，目前版本的FastQC就按照通用引物来评估序列时候有adapter的残留
# -q --quiet 安静运行模式，一般不选这个选项的时候，程序会实时报告运行的状况。

使用fastqc -o #输出结果全路径 #数据存储全路径/*reads_R1.fq命令运行案例数据

运行后可获得如下结果。

Fig.3

结果解读

Basic Statistics 基本信息

Fig.4

报告第一部分既是对质量检测结果的基本信息统计，如上图所示。其中包括：

• Filename：检测的fastq文件名称；

• File type：文件类型；

• Encoding：测序平台的版本和相应的编码版本号；

• Total Sequence：总reads数；

• Sequences flagged as poor quality：低质量序列数量；

• Sequence：测得的序列长度范围；

• %GC：GC含量。

Per base sequence quality 序列测序质量统计

Fig.5

上图显示了检测fastq文件的整体碱基质量分数统计。

• 横轴表示测序文件中所有序列第一个碱基到最后一个碱基，纵轴表示质量得分；

• 红线表示中位数，蓝线代表平均值；

• 柱状表示该位置所有序列的测序质量的统计，柱状（黄色）是25%~75%区间质量分布，error bar（触须）是10%~90%区间质量分布；

• 一般要求所有位置的10%小于20，即最多允许该位置10%的序列低于Q20，即90%的序列的碱基质量都大于Q20，即90%的序列碱基错误率不超过99%。当任何碱基质量低于10，或者任何中位数低于25时报WARN；当任何碱基质量低于5或者任何中位数低于20报FAIL。

Per tile sequence quality 每个tail测序的情况

Fig.6

上图展示了每个tail的测序情况。

• 横轴表示每个碱基的位置；

• 纵轴是tail的Index编号；

• 这个图主要是为了防止，在测序过程中，某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低；

• 蓝色代表测序质量很高，暖色代表测序质量不高，如果某些tail出现暖色，可以在后续分析中把该tail测序的结果全部都去除。

Per sequence quality scores 每条序列的测序质量统计

Fig.7

对每条序列（reads）的测序质量统计。

• 假如我测的1条序列长度为101bp，那么这101个位置每个位置Q值的平均值就是这条reads的质量值；

• 该图横轴是0-40，表示Q值，即该序列（reads）质量得分；

• 纵轴是每个值对应的reads数目；

• 我们的数据中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好。

Per base sequence content 序列各个位置碱基比例分布

Fig.8

上图显示了A T C G在每个位置的平均分布情况。

• 横轴表示每个碱基的位置，纵轴表示百分比；

• 图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量；

• 理论上来说，A和T应该相等，G和C应该相等，但是一般测序的时候，刚开始测序仪状态不稳定，很可能出现上图的情况。像这种情况，即使测序的得分很高，也需要cut开始部分的序列信息。

Per sequence GC content 序列平均GC分布

Fig.9

上图展示了序列平均GC分布。

• 横轴为平均GC含量； 纵轴为每个GC含量对应的序列数量；

• 蓝线为系统计算得到的理论分布；红线为测量值，二者越接近越好；

• 这里不相符可能有两个原因：

1. GC可以作为物种特异性根据，这里出现了其他的峰有可能混入了其他物种的DNA；
2. 目前二代测序基本都会有序列偏向性(所说的 bias)，也就是某些特定区域会被反复测序，以至于高于正常水平，变相说明测序过程不够随机。这种现象会对以后的变异检测以及CNV分析造成影响。

Per base N content N碱基含量分布

Fig.10

上图N碱基含量分布

• N碱基是指仪器不能识别的碱基，一般不会出现。但是如果出现并且量还很大，应该就是测序系统或者试剂的问题；
• 任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"。

Sequence Length Distribution 序列测序长度统计

Fig.11

上图展示了检验文件中序列的长度统计。

• 每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差；

• 比如此图中，126-127bp是主要的，但是还是有少量的120-121bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析；

• 当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信。

Sequence Duplication Levels 统计序列完全一样的reads的频率

Fig.12

• 谈到NGS数据的duplicated reads（暂且翻译为“重复数据”），我们通常会直观地认为：duplicated reads是在NGS文库构建过程中，由于PCR过度扩增导致同一个模板DNA片段被反复测序多次，得到一模一样的reads；

• 上图中横坐标是duplication的次数；纵坐标是duplicated reads的数目（红线）；

• 正常情况下的确，测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication。高程度的duplication level，提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）。

Overrepresented sequences 大量重复序列

Fig.13

• Overrepresented sequences是指一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前200,000条，所以其实参考意义不大，完全可以忽略。

• 和duplication计算一样，取前200,000进行统计，大于75bp只取50bp；

• 发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“；

Adapter Content 序列Adapter

Fig.14

• 此图衡量的是序列中两端adapter的情况

• 如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计

• 本例中adapter都已经去除，如果有adapter序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头。

接下来就是基于QC结果对数据进行质量控制，我们应用cutadapt来做。