大家好，今天又带来一篇11月最新见刊的癌症分型结合免疫微环境文章，还和免疫检查点抑制剂关联，可见这个方向有多热了，肝细胞胆管癌(cHCC-CCA)是一种罕见的原发性肝癌，预后不良。研究人员确定了两种主要的免疫亚型cHCC-CCA(免疫高和免疫低)。被分类为免疫高(immune - high)的肿瘤表现出与适应性、先天免疫、抗原呈递、细胞毒性、免疫抑制和炎症相关的基因过表达。它们还与提高总生存率和显示激活的基因signature有关，这些基因signature最近被证明与肝癌患者抗pd1阻断抗体的反应有关。研究人员的结果可能对未来使用免疫调节剂的临床试验设计和对这种高度侵袭性恶性肿瘤患者的分层具有重要意义。
摘要
目的：
肝细胞胆管癌(cHCC-CCA)是一种罕见的恶性肿瘤，预后不良。研究人员的目的是调查cHCC-CCA的免疫概况，并确定其对疾病结局的影响。
实验设计：
研究人员对96例cHCC-CCA患者进行了一项多中心研究。使用nCounter PanCancer IO 360面板分析基因表达谱。
结果：
通过聚类分析确定了两种主要的免疫亚型:“免疫高”(IH)亚型(57%的病例)和“免疫低”(IL)亚型(43%的病例)。IH类肿瘤表现出与免疫细胞募集、适应性免疫和先天免疫、抗原呈递、细胞毒性、免疫抑制和炎症相关的基因过表达。IH cHCC-CCAs也显示了基因标记的激活，最近表明与肝癌患者免疫治疗反应相关。免疫染色定量证实IH肿瘤的特点是免疫细胞密度较高。免疫亚型与任何基因改变无关。最后，多因素分析显示IH亚型是改善总生存率的独立预测因子。
结论：
研究人员已经确定了一个cHCC-CCA的亚组，显示了持续的肿瘤内免疫应答的特征，同时激活了预测肝癌免疫治疗应答的基因特征。该肿瘤亚型与改善的临床结果相关。这些发现表明，一部分慢性肾脏病-慢性肾脏病患者可能受益于免疫调节治疗方法。
实验材料
研究人员纳入了5所大学医院，
纳入标准如下:
1）可用基线数据和组织学资料，
2）明确的组织学特征，
3）术前抗肿瘤治疗不足。
系统记录了下列临床和生物学特征:年龄、性别、肝病病因(乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)感染、酒精摄入和代谢综合征)、随访(总生存期)、血清甲胎蛋白水平、肿瘤大小、多结节性、卫星结节、血管侵犯(大血管/微血管)和手术边缘。
使用METAVIR评分评估非肿瘤肝纤维化(F0:无纤维化，F1:无隔膜的门脉纤维化，F2:有少量隔膜的门脉纤维化，F3:有很多隔膜的门脉纤维化，F4:肝硬化)。共有96例患者符合研究人员的纳入标准。他们主要是男性(73%)，手术时的中位年龄为59岁。主要的潜在病因是酒精摄入(n= 3745%)、HCV感染(n= 22,24%)、HBV感染(n= 20,22%)和非酒精性脂肪肝炎(n= 11,14%)。50%(27/54)的患者发现术前AFP水平高(20 ng/ml)。一部分患者患有多结节性疾病(n= 23,24%)。绝大多数肿瘤发生在显著纤维化的背景下(METAVIR分期F2-F3或F4, n= 80,83%)(表1)。病变的主要组织学类型为肝细胞型、胆道型和模糊型，分别占43%、25%和27%。
什么是METAVIR分数？
慢性病毒性肝炎肝组织炎症坏死的分级和纤维化程度的分期，推荐采用国际上常用的METAVIR评分系统。简单地说，METAVIR评分是确定肝脏炎症坏死等级和纤维化程度的测试。
肝纤维化可能导致肝硬化，是慢性肝病的标志。因此，医生需要评估任何慢性肝病患者中纤维化的存在和分期。血液检查在评估肝纤维化程度的能力方面有限，肝活检是评估肝脏肝纤维化程度的最优方法。
METAVIR评分为解读肝活检提供了一个模型。行肝活检时，医生需要一种可靠的方法来量化在显微镜下显示的内容。METAVIR评分系统包含两组标准化的数字：一个代表肝组织炎症活动的程度；一个表示肝纤维化的程度。
METAVIR分数的含义
METAVIR评分系统将肝纤维化程度分为0到4五个等级，将肝组织炎症活动度（具体而言，坏死性炎症损伤的强度）分为A0到A3四个等级。
METAVIR评分系统——肝组织纤维化分期评分：
➤ F0=无纤维化
➤ F1 =汇管区纤维性扩大，但无纤维间隔形成
➤ F2=汇管区纤维性扩大，少数纤维间隔形成
➤ F3=多数纤维间隔形成，无硬化结节
➤ F4=肝硬化
METAVIR评分系统——肝组织炎症活动度评分：
➤ A0 =没有活动
➤ A1 =轻度活动
➤ A2 =中等活动
➤ A3 =重度活动
METAVIR分数的作用
METAVIR评分是医生可以使用的众多评估“工具”之一，以帮助确定患者的治疗和监测疾病的进展。2分及以上得分提示应该开始治疗。但情况并非总是如此，因为有些评分较低的个体也可能需要接受个体化治疗。
与大多数评估系统一样，METAVIR系统的优点和缺点并存。其他评分系统是可获得的，例如Knodell评分（也称为组织学活性指数或HAI）。但是，METAVIR评分系统容易使用。
其他不需要进行肝活检的评估纤维化的方法正在研究中，但在目前，肝活检仍是评估纤维化程度的金标准。
METAVIR评分的局限性
尽管METAVIR评分可以作为确定是否以及何时开始治疗丙型肝炎的有效评估手段，但也存在一定的局限性。具有相同METAVIR评分的不同个体可能存在不同的情况，并且治疗需要个体化而不是单独依靠评分来选择治疗。
METAVIR评分也受到肝活检质量的影响。小的活检标本可能无法获得可以代表整体肝脏的评分。METAVIR评分仅来源于肝脏的某一个区域，在肝脏的不同区域也可能存在显著的异质性或炎症和纤维化的变异性。这样，评分可能高估或低估存在的炎症或纤维化的数量。
一般来说，了解纤维化阶段对指导治疗决策是有价值的。例如，纤维化程度可以提示治疗应答的可能性。此外，如果纤维化进展缓慢，最好在开始抗病毒治疗之前等待。
结果
用基因表达谱鉴定cHCC-CCA的两种主要亚型
研究人员通过无监督分层聚类分析研究了所有96例cHCC-CCA样本的基因表达谱，并确定了两种不同的cHCC-CCA免疫亚型，研究人员将其命名为免疫低(IL)和免疫高(IH)(图1A)。分类为IH的肿瘤占57% (n=55)。IH 亚型中显著上调的基因包括细胞因子/趋化因子及其受体(如IFNG、CCL19、CXCL9、IL1B、IL2、IL33、IL4、IL10、IFNA1、CXCR3)、各种免疫细胞亚群的标记物(如CD8A、CD79A、CD19、KIR2DL3、CD209、FOXP3、KLRK1、KLRD1)、免疫调节剂(如PDL1、IDO1、LAG3、TIGIT、CTLA4)、细胞溶解效应物(如PRF1, GZMB, GZMM)，人类白细胞抗原系统成分(如HLA-A, HLA-DRB1, HLA-RB5)和癌症睾丸相关抗原(如MAGEA1, MAGEA4)(图1B)。
IH亚型与手术类型(移植，p=0.05)、相邻肝内肝硬化的存在(p=0.01)、较低的微血管侵犯频率(p=0.01)、和肝细胞的优势(p=0.005)(补充表2)。虽然无监督分层聚类显示了两个主要的cHCC-CCA亚类，但研究人员观察到一定程度的聚类内异质性，在IH肿瘤中发现了两个亚组:子集群IH1(主集群的左侧)和子集群IH2(主集群的右侧)(图1A)。IH1病例约占所有IH cHCC-CCA的一半(n 26/55, 47%)，与亚群IH2相比，显示先天免疫和NK细胞相关基因的过表达(IFNA1, KIR3DL2, KIR2DL3，KIR3DL1)。IL1(主IL簇左侧)和IL2(主IL簇右侧)子簇之间的比较显示癌睾丸抗原。然而，进一步了解这种异质性将需要研究更多的病例。
为了比较cHCC-CCA与常规HCC和CCA的免疫谱，研究人员进一步对来自TCGA的两个独立数据集(TCGA- LIHC n=355和TCGA-CHOL n=36)进行了整合转录组分析，结果显示，cHCC-CCA保留了它们的免疫类别，并聚集在HCC和CCA附近，具有类似的转录组特征(补充图2)。
然后，研究人员的目标是在20例cHCC-CCA(33)的公共数据集上验证研究人员的发现。在研究人员的系列中观察到，无监督层次聚类也显示了2个主要的免疫聚类(高和低)，(补充图3)。研究人员观察到参与各种免疫过程(如适应性免疫或抗原处理)的基因的免疫高亚群上调，由于该数据集病例数量较少，在多次检测调整后，只有9个基因差异仍然显著)。与IH2相比，IH1簇显示出NK细胞相关基因上调的趋势，正如研究人员的系列研究中发现的那样。研究人员还观察到IL1和IL2之间癌症睾丸抗原基因失调的趋势，由于病例数量非常少，在多次测试校正后，差异没有显著性)。总之，这些观察加强了研究人员在一系列肿瘤中所获得的结果。
免疫高型cHCC-CCA的免疫通路激活和免疫细胞浸润增加
为了更好地了解IH肿瘤的生物学，研究人员选择并注释了一系列与主要免疫通路相关的161个基因(图2)。研究人员发现，基因签名与免疫细胞募集、适应性和先天免疫、抗原处理和呈递、IH cHCC-CCA亚型对癌细胞的细胞毒性/杀伤、免疫抑制和调节以及炎症均有上调(图2)。然而，各组中两个亚群对这些通路的激活没有差异。尽管如此，这些亚群显示了参与细胞增殖的不同基因调控(IL1与IL2, p=0.003;IH1与IH2, p=0.004)。
研究人员还通过两种不同的方法:基因表达谱分析和免疫组织化学染色数字图像分析来证实IH肿瘤中免疫浸润增加。研究人员第一次表明,T细胞相关基因集,CD8 T细胞,B细胞,疲惫的CD8 T细胞,巨噬细胞,树突细胞,中性粒细胞和NK细胞在IH cHCC-CCA调节(图3)。与上述集群内异质性一致，研究人员观察到一些IH cHCC-CCA缺乏特定的免疫细胞亚群，如B细胞、中性粒细胞或NK细胞(图3A)。
研究人员进一步随机选取67例患者，对其主要免疫细胞亚群进行免疫组化染色，并用Qupath软件对扫描的数字切片进行密度量化。通过基因表达谱分析得到的结果表明，在IH肿瘤中，CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、CD20+ B细胞和CD68+巨噬细胞的肿瘤内密度较高(图3B和3C)。mRNA表达水平与免疫组织化学之间的相关性见补充图5。MPO+细胞密度有增加的趋势，但没有达到统计学意义(图3B)。鉴于IH亚型与HCC组织学组优势之间的相关性，研究人员对30例HCC中每个组的原位免疫浸润进行了量化，但未检测到任何显著差异(补充图6)。
研究人员最终对96例患者的肿瘤组织中三级淋巴样结构(TLS)进行了量化。根据研究人员的基因表达和免疫组化结果，研究人员观察到在IH肿瘤中TLS密度显著升高。
高免疫cHCC-CCA中与肝细胞癌免疫治疗敏感性相关的基因表达上调
最近的一项研究表明，在使用抗pd -1单克隆抗体nivolumab治疗的晚期HCC患者中，几个基因特征是相关的，可改善临床结果。因此，研究人员的目的是确定属于IH类的cHCC-CCA是否显示了与总生存率和/或客观缓解率显著相关的基因集的上调。
研究人员观察到IH肿瘤的特征是所有这些基因的显著过表达:6-Gene Interferon Gamma签名,Gajewski 13-Gene炎症签名,Sangro炎症签名和T细胞衰竭签名(图4A)。它们明显包括各种细胞因子/趋化因子(CXCL10, CXCL9, CCL4, CCL2)，免疫衰竭/检查点抑制剂(PDL1/CD274, LAG3, PDL2/PDCD1LG2, IDO1)和HLA系统的组成部分(HLA- dma, HLA- dmb, HLA- doa, HLADOB)。最后，由于PDL1也被认为是免疫治疗应答的标志，研究人员也评估了其在50例随机选择的肿瘤和免疫细胞上的表达，但没有观察到样本的免疫亚型有任何差异(补充图8)。
研究人员还研究了研究人员的免疫组与以前报道的HCC免疫级别的基因标记的关系;在该签名的110个基因中，研究人员的面板中有33个基因可用(图4A)。正如预期的那样，研究人员的IH组显示了这些基因的强过表达(图4A)。研究人员进一步的目的是确定研究人员的子组是否与活跃的或耗尽的子类型相关。研究人员比较了不同亚类(CD8A、CD3E、CD3G、IFNG、PRF1、CXCL9、CXCL10、TBX21、CXCL12、CCL2)关键基因的表达差异。除了IH2中CXCL12的表达高于IH1外，在研究人员的1)IH1和IH2亚组以及2)IL1和IL2亚组之间没有差异表达，这表明研究人员的亚组与HCC的这些免疫亚组不一致(补充图9)。
cHCC-CCA免疫亚型与潜在分子改变的关系
利用目标下一代测序，研究人员进一步筛选了随机选择的45个样本，以检测据报道在cHCC-CCA中经常发生的分子改变。调查样本中IH亚类29例，IL亚类16例。最常见的基因缺陷是TP53突变(58%)，其次是MYC扩增(18%)，TERT启动子(16%)，BAP1突变(9%)和FGF19扩增。这些发现与之前研究cHCC-CCA分子特征的研究一致。但没有发现免疫亚型和分子改变之间的任何显著关联(图4B)。
cHCC-CCA的肿瘤内免疫微环境与相邻非肿瘤肝的免疫微环境无关
包括cHCC-CCA在内的plc（原发性肝癌），最常发生于可能影响抗肿瘤免疫的慢性肝病和炎症。因此，研究人员的目的是确定肿瘤的免疫亚型是否与周围非肿瘤实质的免疫浸润有关。首先，研究人员随机选取19例患者，从邻近肝脏中提取mRNA，并使用相同的基因表达面板进行基因表达谱分析。使用主成分分析，研究人员调查了匹配的剖面之间的关系。研究人员观察到，样本倾向于根据其肿瘤或非肿瘤性质聚集，而不是根据获取样本的患者(图5A)。主成分1和主成分2的二维表示也显示肿瘤样本通常位于远离非肿瘤样本的地方(图5A)。研究人员进一步量化了67例进行免疫组化的患者的免疫细胞密度，并根据相邻的cHCC-CCA的免疫亚型比较其值(图5B)。与基因表达实验一致，根据肿瘤的免疫亚型，研究人员没有发现任何非肿瘤免疫细胞密度的显著差异(图5B)。总之，这些结果支持了cHCC-CCA亚型与邻近肝实质的免疫浸润无关的假设。
cHCC-CCA免疫亚型的临床影响
最后，研究人员评估了cHCC-CCA免疫亚型对预后的影响。73例患者有生存资料。未治愈性切除的患者被排除在外。有21人死亡。IH亚型患者24个月、60个月的总生存率分别为90%、80%，IL亚型患者为71%、67%。不同免疫亚型存活时间的Kaplan-Meier曲线如图6所示。单因素分析显示IH亚型，卫星结节，HBV感染显著影响cHCC-CCA患者的总生存时间，死亡风险增加。多因素分析证实IH是一个独立的预后因素。最近有研究表明，非肿瘤肝脏的免疫浸润可能影响HCC的预后，研究人员也评估了这种情况是否也可能发生在cHCC-CCA中。然而，研究人员没有观察到生存率与CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、CD20+ B细胞、CD68+巨噬细胞和MPO+细胞密度之间的任何显著关联(补充图10)。
文章小结
本研究中表明，大约60%的cHCC-CCA属于一个特殊的亚类，其特征是具有显著的免疫浸润，激活与先天免疫和适应性免疫相关的各种途径。虽然还需要通过临床试验进行调查，但可以假设，这种类型的cHCC-CCA患者可能受益于免疫调节剂。事实上，在其他实体肿瘤中，免疫浸润通常与免疫治疗的敏感性增强有关，研究人员观察到了在IH型cHCC-CCA和晚期HCC患者中，与nivolumab应答相关的几个基因特征的富集。这部分就和当前研究热点免疫检查点抑制剂相结合。
同时，虽然分析显示了两种主要的肿瘤簇，但也在IH和IL肿瘤中观察到了不同的亚簇。特别是，IH cHCC-CCA (IH1)的一个子集具有很高的NK细胞和先天免疫相关标记的表达。NK细胞具有良好的抗肿瘤作用，并且它们在肿瘤间质中的存在与改善各种人类恶性肿瘤的预后相关，研究得出的亚型具有更有利的临床结果和丰富的基因特征。表明，这个研究发现可能对未来临床试验的设计和这种高度侵袭性恶性肿瘤患者的分层具有重要意义。
参考文献：
Immune profiling of combined hepatocellular-cholangiocarcinoma reveals distinct subtypes and activation of gene signatures predictive of response to immunotherapy. Clin Cancer Res. 2021 Nov 16:clincanres.1219.2021. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-1219. Epub ahead of print. PMID: 34785581.