文章题目：COVID-19 immune features revealed by a large-scale singlecell transcriptome atlas
发表时间及期刊：2021年2月发表在Cell期刊
影响因子：2020/2021: 38.637
作者：张泽民&金荣华&陈捷凯&王晓群&瞿昆&张政&苏冰&王红阳&王福生&赵平森&李祥攀&程涛&刘新东&卞修武&魏来&贝锦新&黄志伟&蒋庆华&周鹏辉
单位：北京大学生科院&首都医科大学附属北京佑安医院&广州再生医学与健康广东省实验室&广州再生医学与健康广东省实验室&中国科学技术大学生科院&深圳第三人民医院&上海交通大学医学院&第二军医大学国家肝癌科学中心&中国人民解放军总医院第五医学中心&汕头大学医学院附属粤北医院&武汉大学人民医院&中国医学科学院血液病医院&陆军医科大学附属西南医院&陆军医科大学附属西南医院&中山大学中山眼科中心&中山大学肿瘤防治中心&哈尔滨工业大学生科院&哈尔滨工业大学生科院&中山大学肿瘤防治中心
样本：轻度或中度（22名）
重度疾病（54名）
恢复期（57名轻度或中度症状，38名严重症状）
健康对照组（25名）
结论：
1. 庞大的数据集使我们能够确定不同的外周免疫亚型变化与COVID-19的不同临床特征包括年龄、性别、严重程度和疾病分期等密切相关。
2. SARS-CoV-2 RNA存在于多种上皮细胞和免疫细胞中。
3. 以外周血巨核细胞和单核细胞为主要来源细胞的S100A8/A9的上调以及与下游信号通路TLR4的结合，可能是重症患者中常见的细胞因子风暴的重要因素。
研究结果：
1. 新冠肺炎患者scRNA-seq数据分析
本研究将具有轻度或中度症状的患者合并为一组；将有严重症状或处于危重阶段的患者合并为一组，此外还加入了25例根据WHO分类的健康对照者，从外周血（PBMC）和呼吸系统（BALF）共采集的284份样本进行了scRNA-seq测序（图1A）
该队列的年龄范围从6岁到92岁(图S1A)，其中老年患者在重症组中较为丰富，此外，中重度组的性别组成无显著差异 (图S1B)。
在284份样本中，249份来自外周血单核细胞(PBMCs)，有或没有进一步分类B或T细胞，35份来自呼吸系统，包括12份支气管肺泡灌洗液(BALF)样本，22份痰样本，1份胸膜液单核细胞(PFMCs)样本(表S1)。7例患者采集了匹配的BALF和PBMC样本。大多数样本基于10xGenomics5测序平台进行scRNA-seq检测，以生成基因表达和T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)数据(表S1)。我们采用了严格的质量控制标准，最终总共获得了1462,702个高质量的单细胞，平均有4835个独特的分子标识符(UMIs)，代表1587个基因(图S1C-S1E)。共获得了64个细胞簇，覆盖了呼吸系统和外周血中的不同细胞类型(图1B)。【命名原则：细胞类型+cluser+高表达基因】
基于RO/E说明了每个簇的组织偏好(图1C)，即用于消除组织偏好估计的技术变化的观察细胞数量与随机预期细胞数量的比值(Zhang et al.，2018)。值得注意的是，各种增殖的CD8+和CD4+T和浆B细胞簇在BALF中比PBMCs更富集(图1C)。同样，不同患者组中每个患者群的偏好(图1D)，在疾病进展阶段的Covid-19严重患者中，增殖和活化的B和T细胞以及巨噬细胞更为富集。
通过以下基因对这些细胞簇进行准确的注释(图S1F-S1J）。
2. 患者年龄、性别、covid-19严重程度和分期与PBMC组成的关系
1). PBMC中各类免疫细胞的组成变化
我们首先分析了PBMC中各类免疫细胞的组成变化。值得注意的是，PBMCs中巨核细胞和CD14+单核细胞的百分比升高，特别是在疾病进展阶段的严重covid-19患者中(图S2A)。虽然自然杀伤细胞(NK)细胞在不同组间无明显变化，但在Covid-19重症患者中，B细胞显著增加，但T细胞和树突状细胞减少(图S2A)，这与之前报道的淋巴细胞减少现象一致。
2). 年龄、性别、疾病严重程度和分期与PBMCs中免疫细胞组成相关性
大的队列规模使我们能够分析年龄、性别、疾病严重程度和分期与PBMCs中免疫细胞组成变化之间的关系。我们应用方差分析（方差分析）基于159个PBMC样本来询问这种关联，每个样本都有>1000个单细胞。我们还在方差分析模型中纳入了两个技术因素，以控制技术变化，即样本类型(新鲜或冷冻的PBMCs)和样本时间（症状出现后的天数）。经过多次测试校正后，发现了显著的关联(图2A)。值得注意的是，虽然大多数B细胞簇与疾病恢复状态相关，但XBP1+浆细胞(B_c05-MZB1-XBP1)显示出与covid-19的严重程度相关(图2A)。BP1、POU2AF1、PRDM1和IRF4在B_c05-MZB1-XBP1中高表达(表S2)，证实了这一cluster为浆细胞。在covid-19重症患者中，PBMCs中浆细胞的百分比可达到15%，但其他个体均不能达到3%(图2B)。这种增加与样品类型(新鲜或冷冻；图2B)无关，这表明了这一观察结果的稳健性。同样，这种增加也与采样时间无关(图2A和S3A)。这些PBMCs中的血浆B细胞高表达了编码免疫球蛋白A1(IgA1)、IgA2、IgG1或IgG2恒定区域的基因(图2C)，提示它们在分泌抗原特异性抗体中发挥作用。这一观察结果与之前发现的covid-19重症患者血清中含有高滴度的sars-cov-2特异性抗体的结果一致
3）BCR分析
PBMC中浆细胞的增加来自增殖和记忆B细胞的转化(图S2B)。浆细胞前体浆母细胞高表达MKI67，表明其处于增殖状态，并且在重症COVID-19患者PBMC中比例升高，与浆细胞共享最多的克隆型(图S2B和S2C)。表达相对较高水平的CD27，CD80，AIM2，GRIP2和COCH的记忆B细胞亚群（B_c03-CD27-AIM2）是血浆B细胞的第二大主要来源，并且与浆细胞和浆母细胞具有相同的克隆比例(图S2B)。从B_c03-CD27-AIM2到B_c05-MZB1-XBP1的转变得到了BCRs(图S2B)和RNA速度分析(图S2D)的支持。
Neu_c3-CST7是PBMC中最大的中性粒细胞亚群，与患者年龄，COVID-19严重度和疾病期相关(图2A、2E和S3C)。
对于T细胞，高表达MKI67 marker的各种增殖性T细胞亚群表现出与COVID-19严重程度和阶段明显不同的关联（图2A）。T_CD4_c13 MKI67-CCL5low 210细胞在COVID-19患者中升高，尤其是在疾病进展阶段的严重患者中（图2F）。存在三个增殖性CD8 + T细胞亚群，包括T_CD8_c10-MKI67-GZMK，T_CD8_c11-MKI67-FOS和T_CD8_c12-MKI67-TYROBP。他们在COVID-19患者中增加，但与COVID-19严重程度有不同的关联（图2A）。T_CD8_c10-MKI67-GZMK是高表达STMN1，HMGB2，MKI67和GZMK的增生效应记忆CD8 + T细胞群，在重症COVID-19患者中尤其是在恢复期有所增加（图2G）。不同严重程度和阶段的细胞亚群可能表明SARS-CoV-2感染诱导的T细胞应答的复杂性。
T_CD4_c04CD4+T细胞是Tcell增殖的主要来源,在covid-19患者中减少，特别是在疾病进展阶段的严重疾病患者中(图S2F和S2G)。在covid-19重症患者中，增殖CD4T细胞的增加和前体细胞的减少可能部分解释了先前观察到的二分型和不完全适应性免疫(Gaoetal.，2020)。有趣的是，在T细胞中，初始CD8+T细胞(T_CD8_c01-LEF1)显示出与患者年龄最显著的相关性(图2A和2H)，这为年龄偏差的流行病学观察提供了一个合理的解释。此外，还观察到性别相关的T细胞亚群，包括T_CD4_c04ANXA2、T_CD4_c08GZMKFOShigh和T_CD8_c02-GPR183(图S2H、2A和2I)。
在covid-19患者中，大多数T细胞簇减少，并与疾病严重程度的相关性不同。显著减少的T细胞簇包括gdT细胞(T_c14_gdTTRDV2)和黏膜相关不变T细胞(MAIT)细胞(T_CD8_c09-SLC4A10)；高表达TYROBP、KLRF1、CL247和IL2RB(T_CD8_c08-IL2RB)的CD8+T细胞簇；以及三个CD4+T细胞簇显示效应记忆特征(图2A)。因此，covid-19重症患者外周血中gdT细胞和MAIT细胞的减少(图S2I和S2J)已经得到了流式细胞术的支持。
3. TCR&BCR与患者年龄，性别，疾病严重度，所处状态的相关性
ANOVA表明，PBMC中B和T细胞亚群的多样性与各种临床特征具有关联性（图3A）。
严重程度：如T_CD4_c02-AQP3（图3B），T_CD4_c08-GZMK-FOShigh（图3C），T_CD8_c01-LEF1（图3D）和T_CD8_c02-GPR183（图3E）所示，这些T细胞亚群的TCR多样性重度COVID-19患者比中度患者要小，尤其是在疾病进展阶段。
年龄性别：T_CD4_c08- GZMK- FOShigh， T_CD8_c01....(Figure 3F G H I)，这些T细胞亚群的多样性在女性中高于男性，在年轻人中高于老年人。
我们进一步研究了是否可以在covid-19患者中识别出相同的tcr或bcr，但发现了非常有限的共享性(在2例患者中存在4个BCR克隆型)。只有一个非克隆BCR在其重链上具有相同的CDR3氨基酸序列，其中包含1505个sars-cov-2特异性抗体(Raybould等，2020年)。这种常见bcr的缺乏与以往对A71感染和流感疫苗接种后恢复的严重疾病患者的研究形成了对比(Chen等，2017；Jiang等，2013)，表明SARS-CoV-2感染可能不会对bcr的体细胞进化施加巨大的选择压力。
虽然没有发现相同的bcr，但我们注意到，与健康对照组相比，covid-19患者的BCR库表现出有偏差的VDJ使用。我们使用VDJ使用频率训练一个随机森林分类器，以区分中度或重度症状的covid-19患者与健康对照，发现曲线下面积值测量的分类精度高达0.85。在随机森林选择的对区分covid-19严重患者和健康对照的重要的前20种VDJ组合中，有14种与实验验证的中和抗体具有相同的VDJ使用情况(图3J)。值得注意的是，目前已知的sars-cov-2中和抗体的VDJ使用偏向于IGHV3和IGHV1(图3J)。特别是，超过40种中和抗体使用了IGHV3-53。这样的观察结果和数据可能对识别新的中和抗体很重要。
4. 在多种上皮细胞和免疫细胞类型中检测到SARS-CoV-2rna
从处于病程进展期的重症COVID-19中，纤毛，分泌和鳞状上皮细胞以及多种免疫细胞包括中性粒细胞，巨噬细胞，血浆B细胞，T细胞和NK细胞检测到SARS-CoV-2病毒RNA。在BALF中，中度COVID-19患者的细胞较少，未检测到SARS-CoV-2RNA。有趣的是，免疫细胞比上皮细胞具有更多的病毒RNA序列（图4C），并且作者发现ACE2和TMPRSS2在那些上皮细胞的子集中表达。但是，那些免疫细胞不表达ACE2或TMPRSS2，在之前的研究中发现BSG和TFRC与不同细胞类型中病毒RNA的丰度相关（图4E）。由于干扰素刺激基因（ISG）通常与病毒RNA感受相关，因此作者检查了ISG在这些细胞中的表达（图4F）。与PBMC中SARS-CoV-2 RNA阴性的细胞类型相比，ISG基因在这些病毒RNA阳性免疫细胞中表达升高。与BALF中相同类型的病毒RNA阴性免疫细胞相比，SARS-CoV-2 RNA阳性上皮细胞（包括纤毛，分泌和鳞状细胞）以及那些病毒RNA阳性中性粒细胞的ISG水平更高。
我们检测了这些细胞中不同的SARS-CoV-2基因的检出率(图4G)。在我们的队列中，在不同的研究中心，基于10x 5或3测序平台检测到Sars-CoV-2-rna阳性免疫细胞。由于冠状病毒具有亚基因组转录的特征，而SARS-CoV-2的基因组是一条单一的阳性RNA链，如果发生亚基因组转录，接近基因组3端的基因比接近5端的基因有更高的检测率。
5. SARS-CoV-2-RNA阳性和阴性上皮细胞的转录组学差异及其对细胞-细胞相互作用的潜在影响
SARS-CoV-2 RNA阳性和阴性上皮细胞之间的转录组差异及其对细胞相互作用的潜在影响。SARSCoV-2 RNA在不同上皮细胞中的存在似乎与其他转录组学改变有关。对于鳞状上皮细胞，SARS-COV-2RNA阳性细胞表现出多种基因如NT5E，CLCA4和SULT2B1的表达升高（图5A），这些基因富集作用为“对病毒的反应”，“对I型干扰素的反应”和“对缺氧的反应”等途径（图5B）。相比之下，SARS-CoV-2 RNA阳性和阴性纤毛上皮细胞之间的差异基因数量要少得多，几乎没有基因在所有三种上皮细胞类型中显示出一致的变化（图5C）。
接下来，我们探讨了上述转录组学变化的潜在影响。AnnexinA1(ANXA1)在SARS-CoV-2rna阳性的鳞状上皮细胞中上调(图S5A)，通过与甲酰肽受体的相互作用调节中性粒细胞在炎症中的功能(Sugimotoetal.，2016)。这促使我们研究SARS-CoV-2-rna阳性细胞和阴性细胞之间潜在的细胞相互作用差异。CSOmap是一种生物信息学工具，通过配体-受体介导的细胞自组织和竞争来估计三维空间中的细胞-细胞相互作用(Renetal.，2020)，我们估计了计算构建的伪空间中的细胞相互作用潜力。我们发现，sars-cov-2-rna阳性的纤毛细胞、分泌细胞和鳞状上皮细胞在重度和中度组之间表现出明显的相互作用潜能(图5D)。
SARS-CoV-2-RNA阳性的纤毛上皮细胞与自身表现出较低的相互作用潜能，分散在相当于气道的伪空间的外室(图5E、S5B和S5C)，类似于呼吸道冠状病毒感染上皮清除的病理现象(Lee等，2003；Nicolls等，2003)。相比之下，与未检测到病毒RNA的鳞状细胞相比，SARS-CoV-2RNA阳性的鳞状上皮细胞与自身的相互作用潜能增强(图S5D)。这种变化在covid-19患者中是一致的(图5E)。对纤毛细胞、分泌细胞和鳞状上皮细胞的比较也突出了纤毛细胞的分散趋势和鳞状细胞本身之间的相互作用潜力(图5F和5G)。
这种区别不仅存在于上皮细胞之间的相互作用中，也存在于与免疫细胞之间的相互作用中。与纤毛细胞在伪空间外腔室的分散性质相一致，在病毒-rna阳性的纤毛细胞和免疫细胞之间没有观察到明显的相互作用。在中度covid-19患者中，病毒-rna阳性分泌上皮细胞通过SCGB3A1-Marco轴显示细胞与中性粒细胞和巨噬细胞相互作用(图S5E和S5F)，但在covid-19患者中，这种相互作用可能由于carco下调而被抑制(图S5G)。在重症患者中，病毒-rna阳性的鳞状细胞通过ANXA1-FPR1和S100A9/A8-TLR4轴与中性粒细胞和巨噬细胞有显著的相互作用(图5H)。嗜中性粒细胞和巨噬细胞与病毒-RNA阳性的鳞状上皮细胞表现出较高的相互作用潜能，也容易发生SARS-CoV-2RNA阳性(图5I)。据报道，ANXA1-FPR1和S100A9/A8-TLR4相互作用在脓毒症和肿瘤中的免疫细胞招募和炎症级联反应中发挥关键作用。特别是，与中度患者相比，T、B、NK和树突状细胞中S100A9和S100A8的水平显著上调(图S6A和S6B)，表明存在全身炎症反应。TLR4在重度和中度covid-19患者的PBMCs中没有显著差异(图S6A)，但在某些BALF单核细胞和巨噬细胞亚群中显著下调(图S6B)。
6. 巨核细胞和单核细胞亚群是细胞因子风暴的关键外来源
接下来，我们试图调查细胞因子产生的潜在来源。我们首先定义一个细胞因子评分和炎症评分为每个细胞基于收集细胞因子基因的表达和报道炎症反应基因(表S6)，分别使用这两个相关的分数作为指标来评估每个细胞炎症细胞因子风暴的潜在贡献。我们发现患者中细胞因子和炎症基因的表达明显升高，特别是在严重进展阶段(图6A和S7A)，提示存在炎症细胞因子风暴。7种细胞亚型，包括3种单核细胞(Mono_c1-CD14-CCL3，Mono_c2-Mono_c2-HLD14-DPB1和Mono_c3-CD14，T_CD8_c06-TNF，和T_CD8_c09-SLC4A10)和PBMC细胞的scRNA-seq数据检测到更高的细胞因子和炎症评分。有趣的是，巨核细胞与covid-19患者的炎症反应有关，可能会影响疾病阶段的血小板功能，这与之前的一项研究一致(Manne等，2020年)。相比之下，8种细胞亚型表现出更高的细胞因子评分，尽管它们的炎症评分与其他细胞簇相比没有差异。
然后，我们调查了7种细胞亚型在患者中的比例，发现这些超炎症细胞亚型在严重疾病患者中富集(图S7C)。这些超炎症细胞亚型在细胞中的比例在患者组中表现出不同的富集模式(图6B)。Mono_c1-CD14-CCL3在可能伴有炎症风暴的重症患者亚群中高度富集(图6C)，这些细胞的比例也与相应患者的年龄相关(图6D)。高炎症巨核细胞在另一批严重疾病患者中富集，这些患者也可能经历了过度的炎症反应(图6b和6C)。为了确定两种细胞类型是否影响covid-19重症患者的免疫状态，我们进一步根据两种细胞类型是否富集，进一步比较了重症患者的炎症评分(图S7D)。有一种或两种细胞类型的患者比没有两种细胞类型的患者得分更高(图S7E)。
相比之下，Mono_c2-CD14-HLA-DPB1和Mono_c3-CD14-VCAN亚型广泛分布在每个疾病阶段，和炎症T细胞的比例(如T_CD4_c08-GZMK-FOShigh亚型)减少患者严重疾病进展阶段(图6b，6c和S7B)，尽管这两种单核细胞亚型增加比例增加老年恢复期患者(图6d)。综上所述，Mono_c1-CD14-CCL3和巨核细胞可能是PBMCs中触发细胞因子炎症风暴的主要来源，在严重covid-19患者中，细胞比例、炎症表达或两者均升高。某些T细胞亚型也可能通过增强促炎细胞因子的表达来促进炎症风暴。
7. 肺和外周血中高炎症细胞亚型的相互作用
肺和外周血中高炎症细胞亚型的相互作用。细胞因子风暴可能会对肺造成免疫病理损伤，并且已在COVID-19患者的肺组织中证实了大量浸润性炎性免疫细胞。作者对BALF中所有细胞亚型中比较了炎症和细胞因子评分。在上皮细胞中未观察到细胞因子基因的富集，而在进展期的重症样品中，巨噬细胞和单核细胞的亚型具有最高的细胞因子和炎症评分（图7A）。此外确定了5种高炎症细胞亚型，包括Macro_c2-CCL3L1，单核细胞的3种亚型和中性粒细胞（图7B），表明这些细胞亚型可能是导致肺部炎症性风暴的主要来源组织。在BALF样本中未检测到CD4 +和CD8 + T细胞的炎症评分或细胞因子评分升高，这与PBMC中的不同。每个高炎症亚型都高度表达特定的细胞因子。例如，Macro_c2-CCL3L1具体表示CCL8，CXCL10 / 11和IL6。 Mono_c1- CD14-CCL3是外周血和BALF中促炎细胞类型之一，特异性表达高水平的IL1B，CCL20，CXCL2，CXCL3，CCL3，CCL4，HBEGF和TNF。中性粒细胞还表达多种特异性的细胞因子，包括TNFSF13B，CXCL8，FTH1，CXCL16（图7C）。
我们推断，系统性炎症风暴也可能通过分泌多种细胞因子与肺和外周血之间的细胞串扰有关。为了验证这一点，我们分别分析了PBMCs和BALF中重度和中度样本中高炎症细胞亚型之间的配体-受体配对模式(图S8)。PBMCs和BALF细胞之间的相互作用似乎显示重大变化 (Figure 7D). 我们的数据显示，与中度患者相比，重度期患者的高炎症细胞的配体-受体相互作用升高。有趣的是，严重患者外周血细胞之间的相互作用远低于BALF(图S8A)，除了巨核细胞表达IL1B，可能刺激Mono_c1-CD14-CCL3细胞。BALF中的Mono_c1-CD14-CCL3细胞表达CCR5，可接受肺组织和外周血中其他类型细胞分泌的多种细胞因子刺激。相比之下，Macro_c2-CCL3L1细胞的相互作用主要依赖于CCR2和IL1R2。综上所述，这些发现说明了covid-19患者在炎症状态下在肺界面上潜在的细胞-细胞相互作用的分子基础。