探针寻找之旅（9）——BWA-aln比对短序列探针到基因组

BWA-aln简介

• BWA（Burrow-Wheeler Aligner），是一款将DNA序列mapping到参考基因组上的软件，能够将差异度较小的序列比对到一个较大的参考基因组上。有三个比对算法：BWA-backtrack，BWA-SW和BWA-MEM。
• BWA-aln对应的就是BWA-backtrack算法：用于将100bp以内的短序列比对到参考基因组（本来是用来比对 Illumina 的序列的，reads 长度最长能到 100bp），此处就借用来将多条50bp的序列比对到基因组。
• BWA-aln对应的命令：bwa aln/samse/sampe（samse=sample single-end，sampe=sample paired-end）。

项目需求

• 将上千个50bp的染色体探针序列比对到最新版基因组

序列准备

• FASTA格式探针文件（BWA软件支持格式为fasta、fastq以及他们的压缩文件.gz作为比对序列）,可以使用AWK进行调整
• 基因组FASTA文件,可以使用$ less genome.fa | awk '$1 ~"^>"'查看所有序列名（包括染色体），有的基因组含有未组装的Scaffold序列，可以拼作为一条未知染色体，还有的基因组含有线粒体、叶绿体基因组等。

基因组比对

• BWA安装：注意配置 .conda 文件

$ conda create -n bwa python=3.7
$ conda activate bwa
$ conda install bwa

• 建立基因组索引 → 比对到基因组

# bwa建立索引
bwa index csi.chromosome.fa
# 比对到基因组，生成二进制文件（-t 指定线程数）
bwa aln -t 2 -f ./probe1.sai ./genome.fa ./probe1.fa
# 转为sam文件，因为是一条序列的比对，使用单端测序的解读方式
bwa samse -f ./probe1.sam ./genome.fa ./probe1.sai
# .sai文件可以删除了

探针比对结果统计

• sam文件的解读：生信：2：sam格式文件解读，博主写的很全，很厉害

  • 主体部分有11个主列和1个可选列
    QNAME 比对的序列名称 例如：M04650:84:000000000-B837R:1:1101:22699:1759（一条测序reads的名称）
    FLAG Bwise FLAG（表明比对类型：paring，strand，mate strand等） 例如：99
    RENAME 比对上的参考序列名 例如：NC_000075.6
    POS 1-Based的比对上的最左边的定位 例如：124057649
    MAPQ 比对质量 例如：60
    CIGAR Extended CIGAR string（操作符：MIDNSHP）比对结果信息；匹配碱基数，可变剪接等 例如：87M
    MRNM 相匹配的另外一条序列，比对上的参考序列名 例如：=
    MPOS 1-Based leftmost Mate Position （相比于MRNM列来讲意思和POS差不多） 例如：124057667
    ISIZE 插入片段长度 例如：200
    SEQ 和参考序列在同一个链上比对的序列（若比对结果在负义链上，则序列是其反向重复序列，反向互补序列） 例如：ATTACTTGGCTGCT
    QUAL 比对序列的质量（ASCII-33=Phred base quality）reads碱基质量值 例如：-8CCCGFCCCF7@E-
    可选的列 以TAG：TYPE：VALUE的形式提供额外的信息

• 写脚本统计sam结果

$ cat stat2.sh
#! /bin/sh
#
cd $(pwd)
echo -e "probe\tchr1\tchr2\tchr3\tchr4\tchr5\tchr6\tchr7\tchr8\tchr9" > title.txt
for i in $(ls *.sam)
do
        echo ${i%.*} > ${i%.*}.prob
        for j in 'chr1' 'chr2' 'chr3' 'chr4' 'chr5' 'chr6' 'chr7' 'chr8' 'chr9'
        do
                less $i | awk '$3 == "'$j'" {print $0}' | wc -l >> ${i%.*}.prob
        done
done
for i in $(ls *.prob)
do
        paste -s $i > tmp.row
        cat title.txt tmp.row > probedistribution.csv
        cat probedistribution.csv > title.txt
done

• 统计效果

$ cat probedistribution.csv
probe   chr1    chr2    chr3    chr4    chr5    chr6    chr7    chr8    chr9
chr1a   1200    0       0       0       0       0       0       0       0
chr1b   1003    0       0       0       0       0       0       0       0
chr2a   0       1292    0       0       0       0       0       0       0
chr2b   0       1685    0       0       0       0       0       0       0
chr3a   0       0       1065    0       0       0       0       0       0
chr3b   0       0       1097    0       0       0       0       0       0
chr4a   0       0       0       1330    0       0       0       0       0
chr4b   0       0       0       1047    0       0       0       0       0
chr5a   0       0       0       0       1344    0       0       0       0
chr5b   0       0       0       0       1177    0       0       0       0
chr6a   0       0       0       0       0       875     0       0       0
chr6b   0       0       0       0       0       832     0       0       0
chr7a   0       0       0       0       0       0       1106    0       0
chr7b   0       0       0       0       0       0       1110    0       0
chr8a   0       0       0       0       0       0       0       849     0
chr8b   0       0       0       0       0       0       0       1112    0
chr9a   0       0       0       0       0       0       0       0       1134
chr9b   0       0       0       0       0       0       0       0       1182

后续

• 获取bed文件后得到密度文件
• RIdeogram绘制染色体探针分布图(https://www.jianshu.com/p/9b83122a9cdf)

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参考文章

• BWA使用详解
• BWA 命令详解
• 【比对软件】BWA使用
• Manual Reference Pages - bwa (1)
• Burrows-Wheeler Aligner
• 序列比对BWA(Burrows-Wheeler Aligner)