10+ 癌细胞固有表型和免疫表型决定了基底样乳腺癌的临床结局

今天跟大家分享的是最近发表在Clinical cancer research上的一篇文章，影响因子10.107。

Cancer cell-intrinsic and immunological phenotypes determine clinical outcomes in basal-like breast cancer

癌细胞固有表型和免疫表型决定了基底样乳腺癌的临床结局

首先让我们通过摘要了解下这篇文章的主要内容，基底样乳腺癌（BLBC）是一种缺乏靶向治疗的具有侵袭性的乳腺癌固有分子亚型。临床上目前没有可对BLBC患者进行风险分层治疗的测试。那么在这篇文章中作者使用配对设计进行了基因组测序研究，并在五个独立的队列中进行了验证。作者对匹配的复发性和非复发性BLBC肿瘤进行转录组测序来鉴定预后表型。作者主要应用了变量选择算法筛选预后相关的基因，并通过留一法交叉验证，训练了基于前21个基因（BRAVO-DX）的随机森林分类器。在五个独立的BLBC队列中进行了验证，并通过PCR证明了生物标志物的稳健性。好啦~让我们一起来看一看作者具体做了哪些研究吧~

结果展示

1.发现和验证队列的特征

该分析的病例为患有浸润性乳腺癌的20-69岁女性，从1408例I-III期TNBC（ER- / PR- / HER2-）患者中鉴定出了有资格进行此分析的患者，共949人。在分析了患者综合信息后，最终作者选择了67例复发性和67例无复发的BLBC患者，并进行了RNA-seq分析。应用TNBC患者的五个独立队列的公开表达数据进行验证（图1）。

图1.研究设计和基底样队列描述

2. 在发现集中福尔马林固定石蜡包埋组织的转录组分析

从接受过治疗的医院获得了在原发癌直接手术或诊断时收集的乳腺癌组织的治疗前福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块。从134例患者中提取了RNA，用于表征复发性和非复发性乳腺肿瘤的分子和表型特征。作者首先将样本与使用poly（A）+ RNA-seq进行分析的包括基底样，管腔，HER2扩增和正常样肿瘤的TCGA乳腺癌队列进行了比较。发现基底样TCGA癌，以及90.8％的肿瘤被归类为PAM50基底样内在亚型。接下来，作者验证了复发状态不受技术协变量的影响，发现肿瘤纯度与复发无相关性。此外，两组样本中ER（ESR1），PR（PGR）或HER2（ERBB2）的水平没有升高。

3. 肿瘤分子特征与复发的关系

在这一部分，作者首先识别了复发性和非复发性肿瘤的差异表达基因（DE），然后对重要DE基因进行功能富集分析（图2）。共识别到560个差异表达基因。其中239个基因与预后良好相关，321个基因与预后不良相关。对风险基因进行富集分析发现其显著富集于上皮标志物和几种细胞分化特征中。生存基因显著富集了免疫细胞标记和免疫相关标记。接下来作者评估了复发是否与不同的分子或组织化学亚型相关。根据前100个风险相关基因的表达水平对患者进行聚类共分为了三类，其复发风险差异很大。病理学检查评估发现低风险组具有较高的淋巴细胞浸润而高风险组的免疫浸润低并且高风险和低风险组表达差异明显。这些结果表明BLBC的复发风险与整合癌细胞固有和免疫细胞外在表达模式的转录组表型显著相关。

图2.复发性和非复发性BLBC肿瘤的转录特征

4.免疫基因组与无复发生存的相关性

根据以上的结果，作者在这一部分更详细地探讨复发性和非复发性BLBC肿瘤之间的免疫学差异。作者首先应用CIBERSORT方法根据细胞组成来表征肿瘤微环境，发现按照复发风险分组的肿瘤在免疫浸润的总水平以及组成特征方面差异很大（图3）。作者还比较了三组之间的巨噬细胞，T细胞和B细胞的水平，发现低危肿瘤中这三种细胞的比列明显高于另外两组。随着风险程度的升高，调节性T细胞（Treg）的比例增多。然而自然杀伤（NK）细胞表现出相反的趋势。作者还观察到肿瘤浸润性T和B淋巴细胞的丰度与克隆扩增程度（较低的Gini指数）之间存在显著相关性。

图3.BLBC复发风险与免疫基因组学相关性

5. BLBC和TNBC中无复发生存的鲁棒模型的开发和验证

由于BLBC肿瘤表型和预后分层明显，作者在这里开发了预后基因和分类算法（图4）。作者首先进行了严格的变量选择和交叉验证。其中风险基因和生存基因高度相关，因此不能用作预后独立标记物。作者使用了多种变量选择算法来筛选特征基因。根据基因的非冗余性和分类的预期效果进行了排名。通过训练随机森林（RF）分类器，通过LOOCV来增加基因数量，最后选择排名靠前的21个基因作为BRAVO-DX进行进一步评估。结果发现BRAVO-DX代表具有相关表达模式的更大的独立基因集。为了评估这组基因是否涵盖癌细胞内在和免疫细胞外在的表达模式，作者将BRAVO-DX基因的表达与预测的免疫细胞丰度相关联。结果显示大约一半的基因与预期的免疫细胞丰度负相关，而不是免疫细胞标记，因此表明它们由肿瘤细胞内在表达。作者使用先前提出的成本敏感型学习来训练具有所需分类特征的分类器。在最佳采样率下，该分类器在识别复发病例中具有较高的灵敏度。并且BRAVO-DX评分可以可靠地识别出无复发生存期具有显著差异的患者组。为了进一步证明BRAVO-DX的临床实用性，作者继续在独立的验证队列中测试其预后性能，定义了BRAVO-DX的子集BRAVO-IMMUNE包含了12个肿瘤免疫表型相关基因。还定义BRAVO-DX的最小子集仅包含三个最显著的风险和生存基因（IKZF3, AIM2和 ELF3）。

图4.开发和表征预后基因标志

接下来作者选择了三个乳腺癌队列来评估该分类器的准确性（图5）。结果表明所有验证队列中，BRAVO-DX和BRAVO-IMMUNE的总体生存率均较高并且三个独立的基因IKZF3，AIM2和ELF3也与无复发生存率显著相关。

图5.BRAVO-DX基因表达标志的验证

为了测试BRAVO标记在临床领域的应用，作者使用基于TaqMan的实时PCR的技术，使用一部分肿瘤样本来验证所选的生物标记（图6）。结果发现通过实时PCR对所选基因的定量与RNA-seq高度一致并且TaqMan PCR测定法很好地保留了复发和非复发病例之间风险基因和生存基因表达的差异。为了测试qPCR结果在预测复发时的准确性，使用从线性回归得出的公式将Ct值转换为logFPKM，并将其应用于从RNA-seq数据训练的随机森林模型中。结果发现两个平台的预测结果是高度一致的。

图6.使用TaqMan实时PCR测定法验证BRAVO-DX标志

好啦~这篇文章的内容就这么多啦，本研究的结果表明BLBCs及其微环境的表型特征与无复发生存相关，并证明了内在和外在表型作为BLBC中独立的预后生物标记物的实用性。

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