Chip-seq原理篇

CHIP-seq

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

实验流程：

（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（这一步一般会检测下交联情况）
（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；
（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（chip级别的抗体，会有效率问题存在，很考验抗体质量和操作）
（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；
（5）将准备好的样本进行深度测序（一般会准备空白对照，排除假阳性，有两种，1.input DNA：不用任何抗体拉的DNA；2.mock IP DNA：用不含有抗体的DNA）

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分析流程：

（1）质量控制，质量可以先用fastqc快速可视化一下，很多上传到geo的数据质量都非常棒，基本不用什么处理，如果需要处理，trimmomatic，cutadapter，trim galore等等。
（2）序列比对，用bowtie2或者bwa都可以（但是这里有一个问题，很多文章他会提到read uniquely mapped 来进行下游分析，bowtie可以通过设置-m 1 参数，但是对于bowtie2以及bwa，并不存在这样的参数，可以使用bwa输出中的XT:A:U(用于标记unique hit)以及tophat中的NH:i:1(用于标记unique hit)来进行过滤，bowtie2则可以根据sam或bam文件的tag来提取)

grep “AS:” aligned.sam | grep –v“XS:” >unique_alignments.sam

（3）peak calling，macs（做很长的修饰peak时，可以考虑rseg）

（4）peak注释，Y叔的chipseeker，deeptools也很棒，我看很多文章的profile图都是deeptools画的

质控和序列比对，NGS步骤都差不多，chipseq主要不同在于callpeak

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我们测得的read只是跟随着TF一起沉淀下来的DNA fragment的末端，所以它体现的read位置不是真实的TFbindind的位置。在callpeak之前，read会进行延伸，延伸的reads会平均的分布到正负链，因此在TFbind的附近会形成双峰。MACS会根据某个window size扫描基因组，统计每个window里面的reads富集程度，然后抽取合适的window做样本，建立双峰模型，而双峰之间的距离就被认为TF的长度D，每个read延伸D/2的长度。