【无标题】
大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。本期我们聚焦植物逆境胁迫响应的表观遗传调控机制。
DNA甲基化在对环境刺激的反应中起着至关重要的作用。植物DNA甲基化会随着各种非生物胁迫条件而变化，包括高温、低温、干旱、高盐碱、渗透胁迫、紫外线辐射、土壤养分缺乏、激光照射、金属胁迫、缺氧与再氧合、农药和气候变化等。包括拟南芥、棉花、水稻、玉米等在内的植物DNA甲基化在逆境胁迫响应中的变化已进行了广泛的研究，小编选取3篇不同植物在不同非生物胁迫条件下的DNA甲基化变化研究文献，分别为拟南芥在干旱胁迫、棉花在高温胁迫、水稻在干旱和盐胁迫中的抗逆机制研究，并对植物DNA甲基化抗逆机制研究套路进行总结，一起来看看吧。
01拟南芥 抗干旱
标题：Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects（营养期轻度干旱诱导的拟南芥表型、基因表达和DNA甲基化可塑性响应）
期刊：J Exp Bot.
2021影响因子: 6.992
发表时间：2020.06.22
技术平台：表型鉴定、WGBS、RNA-seq
摘要：
在植物中，通过DNA甲基化的表观遗传机制，可以在没有DNA序列突变的情况下发生可遗传性状变异。然而目前尚不清楚这种替代性遗传机制能否对环境变化做出反应，能否为植物提供快速产生适应性遗传表型变异的方法。为了评估环境诱导的潜在跨代效应，作者在一个多代实验中对拟南芥的四种自然品种和对照品种Col-0进行轻度干旱处理。与预期一致，在每个品种中都观察到对干旱的可塑性响应和亲本环境的许多代际影响。然而除了极少数基于性状的亲本效应外，无论是自然环境还是干旱环境下生长，胁迫和非胁迫植物的后代在表型上难以区分。此外，Col-0全基因组DNA甲基化和对应的基因表达分析表明，虽然轻度干旱暴露诱导了植物的DNA甲基化变化，但这些变异没有被遗传。本研究表明，轻度干旱胁迫不会诱导跨代表观遗传效应。
材料方法：
作者选取4种自然品种Shahdara（Sha；236AV）、Bur-0（172AV）、Tsu-0（91AV）和Cvi-0（166AV）和对照品种Col-0（186AV），在充足水分控制或轻度干旱胁迫两种不同条件下，每个品种的近交基因系都生长四代。取叶样进行高通量表型鉴定，对样本生长规模和相对增长分析以及基于表型形状的亲本效应分析。
图：多代实验设计示意图（G植物生长每代；P表型试验）
为证实轻度干旱对基因表达的影响，作者从干旱胁迫条件和对照Col-0植物中采样的叶子进行RNA-seq（每次3个重复，共6组数据），每个样本获得1830-2370万reads（平均20.7M）。
为研究全基因组DNA甲基化模式在轻度干旱中的可塑性响应，对从对照和干旱胁迫处理的12株Col-0植物播种后第29天的成熟叶片提取的混合DNA进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）（各1个样本，2组数据）。为评估代际效应，作者对在标准试管条件下生长10d龄的5个C1C2和5个S1S2 G2株系幼苗进行WGBS测序分析。
结果：
作者对两代拟南芥进行了详细的表型分析，并使用个体相对生长率作为应激反应的综合指标。使用RNA-seq对干旱胁迫的基因表达进行验证，并在Col-0的DNA甲基化水平上评估了代际表观遗传学的可能性。研究结果表明，轻度干旱诱导了所有样本的表型可塑性响应，但没有导致遗传效应方面的任何明显变化。此外，DNA甲基化数据表明，轻度干旱只引起DNA甲基化代内变化，这种变化仅限于CHH位点，主要影响TE序列。总之研究结果证实，植物通常不会因环境变化而产生跨代效应。本研究结果为植物首先通过转录通路或对后代表型的亲本影响，从而对生理应激源作出响应的观点提供了强有力的支持。
图：应激诱导的DNA甲基化部分变化表征
02棉花 耐高温
标题：Disrupted genome methylation in response to high temperaturehas distinct affects on microspore abortion and anther indehiscence（DNA甲基化对于高温胁迫下花粉活性和花药开裂具有不同的调控作用）
期刊：The Plant Cell
2021影响因子: 11.277
发表时间：2018.06.04
技术平台：WGBS、RNA-seq、24nt小RNA、qRT-PCR
摘要：
高温胁迫诱导雄性不育，导致作物产量下降。DNA甲基化调控植物发育和应激反应相关的一系列过程，但DNA甲基化在高温条件下雄性不育中的作用仍然未知。作者通过进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）来分析高温和常温条件下棉花（Gossypium hirsutum）花药中的DNA甲基化水平，以研究DNA甲基化在高温下雄性育性中的调控作用。在高温中检测到DNA甲基化整体水平的波动，尤其是CHH甲基化（H=A，C/T），24nt小RNA表达水平的变化与DNA甲基化水平显著相关。在常温中，DNA甲基化抑制实验导致高温中的花粉不育，但不影响花药的正常开裂。进一步的转录组分析表明，高温中花药的糖类、活性氧（ROS）代谢通路的基因表达受到显著调控，但生长素的生物合成和信号传导通路仅略有变化，表明高温通过破坏DNA甲基化干扰糖类和ROS代谢，导致雄性败育。这项研究开辟了使用表观遗传学技术培育耐高温品种的途径。
材料方法：
课题组前期鉴定了两个在高温下存在表型差异的棉花（Gossypium hirsutum）品种：“84021”（耐高温）和“H05”（敏高温）。将其在温室中以14小时日光/10小时夜光进行周期培养。常温条件：白天29–35°C，夜间25–28°C。高温条件：39-41℃，夜间29-31℃。在常温条件下，将DNA甲基化抑制剂Zeb溶液（Zeb溶于蒸馏水，浓度150μM ）喷洒到所有芽上以抑制DNA甲基化。五天后，一半植物作高温处理，另一半维持在常温下。同时在相同条件下培养用蒸馏水处理的植物用作对照，将不同批次样品在高温或Zeb溶液处理下作为不同的生物学重复单独储存。
对芽取样并按芽长构建为四分体期（6-7mm）、绒毡层降解期（9-14mm）和花药开裂期（>24mm）。对同一品种相同时期的花药汇集在试管中，并储存在-70°C液氮中或立即使用。提取DNA进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和对应的转录组分析（24nt小RNA，RNA-seq），并进行qRT-PCR验证。
结果：
作者采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）对“84021”和“H05”分别在常温和高温条件下构建四分体时期、绒毡层降解时期和花药开裂期三个重要花药发育时期的DNA甲基化差异图谱。结果阐明在高温胁迫下，“H05”呈现出相对较低的DNA甲基化水平，而“84021”则一直维持在较高的DNA甲基化水平。“H05”中较低的24nt小RNA数量暗示着小RNA介导的DNA甲基化通路（RdDM）受到影响。通过外施DNA甲基化抑制剂，发现“H05”在常温下出现了类似高温胁迫下花粉不育的表型，但与此同时花药壁却正常开裂。进一步的RNA-seq结果显示，糖和活性氧代谢通路明显受到DNA甲基化调控，而生长素通路在抑制剂的处理下却没有出现明显的变化。本研究首次绘制了高温与常温下棉花花药中的DNA甲基化图谱，并首次发现高温胁迫下导致的花粉不育和花药壁不开裂表型受不同通路调控，这对进一步研究高温导致雄性不育的机理，培育耐高温品种具有重要意义。
图：高温胁迫下花药发育过程中雄性生育表型和DNA甲基化模式
03水稻 耐高温+耐高盐
标题：Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars（WGBS测序揭示水稻在干旱和盐胁迫下的DNA甲基化变化）
期刊：Genomics
2021影响因子: 5.736
发表时间：2020.09
技术平台：WGBS、RNA-seq
摘要：
先前研究已鉴定正常生长条件下不同水稻品种之间的DNA甲基化模式和甲基化差异，包括胁迫敏感（IR64），耐旱（Nagina 22）和耐盐（Pokkali），不同品种之间的甲基化差异主要出现在CG位点。为进一步了解DNA甲基化在干旱和盐度胁迫下的作用，作者通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析了三组水稻品种（IR64，Nagina 22，Pokkali）在干旱和盐胁迫条件下DNA甲基化的作用。基因组CG位点中的甲基化和远端启动子区域CHH位点中的甲基化与基因表达正相关。Nagina 22中的低甲基化、Pokkali响应干旱和盐度胁迫的高甲基化分别与少数非生物胁迫应急响应相关的基因高表达相关。大多数差异甲基化区域和差异表达基因（DMR-DEGs）具有品种特异性，表明DNA甲基化在水稻非生物胁迫响应中以品种特异性的方式起重要作用。此外，作者鉴定了因启动子区域和/或编码区域中敏感和耐受品种DNA多态性而具有差异甲基化胞嘧啶的DMR-DEGs，表明表位基因在非生物胁迫响应中的作用。
材料方法：
作者分析了三种对非生物胁迫具有对比反应的水稻品种，包括耐干旱的Nagina 22，耐盐的Pokkali和对两种胁迫条件敏感的IR64。将两周龄水培生长的水稻幼苗IR64和Nagina 22用用纸巾折叠包裹3小时作干旱处理。将幼苗放在浓度为200mM的NaCl溶液中3小时来作盐胁迫处理，胁迫处理的幼苗与对照组幼苗一起在水中保持相同的持续时间。收获胁迫处理的幼苗，在液氮中快速冷冻并储存在−80°C。提取基因组DNA并进行全基因组重亚硫酸盐测序分析和相对应的转录组分析。
结果：
本研究对IR64、Nagina 22 和 Pokkali三种水稻品种在胁迫处理后的 DNA 甲基化变化进行测序分析，并与对照条件进行比较。采用WGBS联合相对应的RNA-seq测序分析鉴定了三组水稻幼苗暴露于干旱胁迫和盐胁迫的全基因组DNA甲基化变化、蛋白质编码基因和TEs中的DNA甲基化、DNA甲基化对基因表达的影响、水稻幼苗在非生物胁迫下的差异甲基化区域、干旱胁迫和盐胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的相关性，并验证了差异甲基化与DNA多态性在非生物胁迫反应中的作用。总体而言，本研究证明了DNA甲基化在水稻非生物胁迫反应中的特异性作用。
图：干旱胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的关联分析
图：盐胁迫条件下差异甲基化与差异基因表达的关联分析
易基因小结：植物DNA甲基化抗逆机制研究套路
植物DNA甲基化在非生物胁迫条件下的变化研究一般遵循三个步骤进行数据挖掘。首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析（WGBS、Plant-RRBS等方式），包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
参考文献：
Van Dooren TJM, Silveira AB, Gilbault E, et al. Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects. J Exp Bot. 2020;71(12):3588-3602. doi:10.1093/jxb/eraa132
Ma Y, Min L, Wang M, Wang C, Zhao Y, Li Y, Fang Q, Wu Y, Xie S, Ding Y, Su X, Hu Q, Zhang Q, Li X, Zhang X. Disrupted Genome Methylation in Response to High Temperature Has Distinct Affects on Microspore Abortion and Anther Indehiscence. Plant Cell. 2018 Jul;30(7):1387-1403. pii: tpc.18.00074. doi: 10.1105/tpc.18.00074.
Rajkumar MS, Shankar R, Garg R, Jain M. Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars. Genomics. 2020 Sep;112(5):3537-3548. pii: S0888-7543(19)30983-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.04.005. PubMed PMID: 32278023.
猜你想看：
3文聚焦：DNA甲基化对果实成熟的重要作用（橙+番茄+草莓）
3文解读：微量样本甲基化测序在肿瘤中的应用
3文一览：简化甲基化测序（RRBS）技术优势及研究成果
常用的6种DNA甲基化测序方法，你知道几个？
精准医学 | 十篇文章读懂DNA甲基化与疾病（肿瘤）的关系
经验分享：DNA甲基化与多组学研究思路及科研论文写作
原文解读：
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwNTY3NDIxMw==&mid=2650649791&idx=1&sn=2b8f3071d6627e0c89b4172a888e3242&chksm=83101135b4679823eff20e44fe4078b6dc6f54d6a4bb7bf4e0b9cc40d686170e74643840ad6f&token=608561748&lang=zh_CN#rd