RNAseq教程(4.5)

目录

1.Module 1 - Introduction to RNA sequencing

1. Installation
2. Reference Genomes
3. Annotations
4. Indexing
5. RNA-seq Data
6. Pre-Alignment QC

2.Module 2 - RNA-seq Alignment and Visualization

1. Adapter Trim
2. Alignment
3. IGV
4. Alignment Visualization
5. Alignment QC

3.Module 3 - Expression and Differential Expression

1. Expression
2. Differential Expression
3. DE Visualization
4. Kallisto for Reference-Free Abundance Estimation

4.Module 4 - Isoform Discovery and Alternative Expression

1. Reference Guided Transcript Assembly
2. de novo Transcript Assembly
3. Transcript Assembly Merge
4. Differential Splicing
5. Splicing Visualization

5.Module 5 - De novo transcript reconstruction

1. De novo RNA-Seq Assembly and Analysis Using Trinity

6.Module 6 - Functional Annotation of Transcripts

1. Functional Annotation of Assembled Transcripts Using Trinotate

4.5 Transcript Assembly Visualization (Splicing Visualization)

Visualizing Results at the Command Line

从“de_novo”模式查看合并后的GTF文件。请记住，这个合并的GTF文件结合了UHR和HBR(每个单独的GTF也在前面生成)。

cd denovo
head stringtie_merged.gtf

有关该文件格式的细节，请查阅以下链接

• https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gff.shtml#gffcompare
• http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffmerge/index.html
• http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffcompare/index.html#transfrag-class-codes

在“de_novo”结果中，有多少基因至少有一个由StringTie组装的转录本?

cat stringtie_merged.gtf | perl -ne 'if ($_ =~ /gene_id\s+\"(\S+)\"\;/){print "$1\n"}' | sort | uniq | wc -l
565

有多少基因至少组装了一个潜在的新转录本?

head gffcompare.stringtie_merged.gtf.tmap
grep "j" gffcompare.stringtie_merged.gtf.tmap
grep "j" gffcompare.stringtie_merged.gtf.tmap | cut -f 1 | sort | uniq | wc -l
174

显示具有最高阅读支持度的基因间区域(候选新转录区域)的转录本

cd denovo
grep -w "u" gffcompare.stringtie_merged.gtf.tmap | sort -n -k 10 | column -t
-  -  u  MSTRG.481  MSTRG.481.1  3  0.000000  0.000000  0.000000  260  MSTRG.481.1  -
-  -  u  MSTRG.482  MSTRG.482.1  2  0.000000  0.000000  0.000000  267  MSTRG.482.1  -
-  -  u  MSTRG.54   MSTRG.54.1   2  0.000000  0.000000  0.000000  279  MSTRG.54.1   -
-  -  u  MSTRG.434  MSTRG.434.1  3  0.000000  0.000000  0.000000  281  MSTRG.434.1  -
-  -  u  MSTRG.484  MSTRG.484.1  2  0.000000  0.000000  0.000000  319  MSTRG.484.1  -
-  -  u  MSTRG.3    MSTRG.3.1    2  0.000000  0.000000  0.000000  320  MSTRG.3.1    -
-  -  u  MSTRG.200  MSTRG.200.1  2  0.000000  0.000000  0.000000  344  MSTRG.200.1  -
-  -  u  MSTRG.391  MSTRG.391.1  2  0.000000  0.000000  0.000000  346  MSTRG.391.1  -
-  -  u  MSTRG.2    MSTRG.2.1    2  0.000000  0.000000  0.000000  400  MSTRG.2.1    -
-  -  u  MSTRG.94   MSTRG.94.1   3  0.000000  0.000000  0.000000  424  MSTRG.94.1   -
-  -  u  MSTRG.410  MSTRG.410.1  2  0.000000  0.000000  0.000000  939  MSTRG.410.1  -

使用RegTools来注释所有的可变剪切

RegTools用于帮助描述单个外显子剪接事件，并帮助识别对基因表达或剪接模式有直接影响的新剪接事件。更多细节请参考RegTools手册。

使用RegTools的基本功能来提取可变剪切。每个bam的bed文件，它总结了RNA-seq数据中所表示的所有不同的外显子-外显子剪接事件。我们还将使用RegTools对这些连接进行注释，以参考我们的GTF转录组文件:

cd align
regtools junctions extract -s 0 HBR.bam -o HBR.junctions.bed
head HBR.junctions.bed
    
regtools junctions annotate HBR.junctions.bed  ../chr22_with_ERCC92.fa ../chr22_with_ERCC92.gtf > HBR.junctions.anno.bed
head HBR.junctions.anno.bed

regtools junctions extract -s 0 UHR.bam -o UHR.junctions.bed
head UHR.junctions.bed
    
regtools junctions annotate UHR.junctions.bed  ../chr22_with_ERCC92.fa ../chr22_with_ERCC92.gtf > UHR.junctions.anno.bed
head UHR.junctions.anno.bed

现在从样本中找出任何可能涉及新外显子跳跃、受体位点使用或供体位点使用的连接(相对于参考转录组GTF)。

grep -P -w "NDA|A|D" HBR.junctions.anno.bed | perl -ne 'chomp; @l=split("\t",$_); if ($l[4] > 3){print "$_\n"}'
grep -P -w "NDA|A|D" UHR.junctions.anno.bed | perl -ne 'chomp; @l=split("\t",$_); if ($l[4] > 3){print "$_\n"}'

转换成GTF文件查看

为了更容易比较仅ref-only, ref-guided, de novo 的结果的输出，我们现在将生成合并后的GTF文件的过滤版本，我们将删除转录本，除非有证据表明它们的表达。

wget https://github.com/griffithlab/rnaseq_tutorial/blob/master/scripts/stringtie_filter_gtf.pl
perl stringtie_filter_gtf.pl --expression_metric=FPKM --result_dirs='HBR_Rep1,HBR_Rep2,HBR_Rep3,UHR_Rep1,UHR_Rep2,UHR_Rep3' --input_gtf_file='../chr22_with_ERCC92.gtf' --filtered_gtf_file='chr22_with_ERCC92.filtered.gtf' --exp_cutoff=0 --min_sample_count=2