qPCR数据处理

这次，我们来介绍一下qPCR的数据处理。

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qPCR是什么操作

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途：

• DNA 定量
• RNA 定量
• Genotyping (设计特性型基因探针，通过荧光判断基因型)

qPCR

qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为绝对定量和相对定量。

• 绝对定量 是通过利用已知浓度的DNA样本绘制标准曲线，然后得到未知样的DNA含量
• 相对定量 是通过与管家基因的比较得到相对的基因表达值

好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。

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qPCR怎么个q法

qPCR和PCR一看名字就知道很像，q就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌）

那么， 怎么通过qPCR定量呢？

其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。

具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量大于DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值.

qCR是嘛玩意儿

理想情况下,比如你的样本中DNA1有32条，DNA2有8条，那么我们如果设置阈值在1024条，那么DNA1需要5次循环， DNA2需要7次才能到达，也就是说相差两次循环，一次循环是翻一番，两次就是4倍，这样我们就知道了 DNA1的量为DNA2的两倍 这就是相对定量

如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。

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如何计算

在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单

一个仿真例子：

我用某一药物处理了细胞，我想知道该处理对细胞内geneA的转录水平的影响。

那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间RNA产量，RNA质量以及逆转录效率上的差别。

最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT）

公式如下

• ΔCT = CT(target gene)−CT(reference gene).
• ΔΔCT = ΔCT(target sample)−ΔCT(reference sample)

即先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异，而我们的表达量的差异就可以表征为

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重点来了

虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件，

但是。。。。。

这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的

而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。

在bing搜索"头大"

于是乎

秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量

该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行）

程序预览图

20190701 更新

在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。

大家感受一下，一键出图的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末

zzzz.gif

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获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦

文章直通车>>> origin科研作图

由于我想使用下微信的后台回复功能，小工具链接就不放在这了，有需要的同学请在微信公众号肖恩札记后台回复qPCR获取工具。

此工具如有任何问题或者你们有什么建议或者链接失效等情况，请于同名微信公众号留言