【bioinfo】bwa mem 比对分值参数测试

• 常用的序列比对软件bwa：
  
  command对应的多种命令，这里使用的是mem，即使用BWA-MEM算法进行序列比对。

• bwa mem命令比对：
  下方官网上介绍的mem命令：
  

• bwa mem 比对分值参数：
  

  参数	默认	比对情况	分值	说明
  -A	[1]	Match	1	1bp比对得1分
  -B	[4]	Mismatch	-4	1bp错配扣4分
  -O	[6,6]	gap(ins,del)	-6,-6	1bp的ins扣6分，del扣6分
  -E	[1]	gap extension	1	发生extension罚分系数
  -L	[5,5]	soft clipping	-5,-5	在5’端,3’端的softclip扣5分
  -U	[17]	unpaired read	-17	不成对的read扣17分

  • -E: g+[1]*s (g:gap罚分值, s:gap的长度(从第1bp的gap开始算), [1]:该参数设定)
  • -L: 按错配/indel，还是按softclip。 是选择分值高的作为最优比对。该分值设定越大，即对softclip的惩罚越大，那么选择最优比对时，更倾向于错配/indel（尽可能的比对上，而不是直接给出softclip），同样带来的弊端就是有很多错配。但是softclip的分值则不在AS中显示

• 测试分值相关参数：

  Test1：

  $ BWA mem -M -k10 -T10 ref.fa tst1.fq > tst1.sam
  $ cat ref.fa
  >seq1
  CACGATGTCTCTCCTCTTAATGTGCTGCACATCTGTAGGATGGGGACAAA
  

  该测试主要针对序列的长度，以及有错配/Ins/Del的情况。
  
  其中：
  -M: mark shorter split hits as secondary (标记secodary比对结果)；
  -k: minimum seed length [19] （比对的序列最短长度，默认是19bp）；这里设定10。

  这里的seed不是太明白，是否是指read序列，还是有别的含义？测试是序列可比对长度低于该阈值，则不显示比对结果。

  -T: 比对的最小分值阈值，默认值30。即比对得分值<30不输出比对结果（结果显示未比对上），比对得分值>=30输出比对结果。这里设定10。

  [-k]参数的作用优于[-T]，就是说，如果[-k]设定长度阈值较高（eg:19bp)，而[-T]参数设置较低(eg:10，即分值最低为10），那么当read长度达不到19bp (但比对分值>=10)，结果仍认为是未比对上。

  ref.fa: fasta格式的参考序列文件；
  tst1.fq: 输入的fq文件；
  tst1.sam：输出sam格式比对结果文件。

  该测试其他分值参数使用的是默认值，以read id 为 2del2ins的序列为例计算分值：

  - CIGAR值得为：13M2D8M2I12M10S；(M:match;D:del;I:ins;S:softclip)
  - AS tag给出比对分值："AS:i:17"（17分）
  - 分值计算：
  	- match得分：13+8+12=33
  	- indel罚分：(6+1*2)+(6+1*2) = 16 (ins和del各有两个）
  	- 最终得分：33-16=17
  

  注意：这里的分值并没有计算softclip，因为softclip的分值是在比对过程中，用于计算：
  是将一端的序列视为softclip还是视为可比对（有match、mistmach、indel)；
  如果按比对的分值>视为softclip分值，则选择比对上结果，反之，视为softclip。

  Test2：
  测试靠近read两端位置出现错配， 比对结果是match/mismatch还是softclip？

  $ BWA mem -M ref.fa tst.fq > tst.sam
  $ cat ref.fa
  >ref
  TCGTCAATTCCAGGCCAGCCCATGAAGTGAGCAGA
  

  
  比对结果中，分值计算：

  readID: "match"是完全match，碱基数35，分值是: 35；
  readID: "mis1"第三个碱基有一个碱基错配，比对上的碱基有34，得分值：34+(-4)=30；
               (奇怪：这里为什么给到分值(AS)是32？)
  readID："mis1_ins1"是有一个碱基错配，和一个ins。
  		 - 如果按错配+ins，可match碱基是34个，得分是：34+(-4)+(-6)=24；
  		 - 如果从ins处及左端(5')视为6bp的softclip(罚5分)，分值是：34+(-5)=29。
  		 - 也就是按softclip分值更高，所以比较结果给出的是softclip。
  

注意：bwa比对时，如果序列长度和碱基质量值不同，bwa比对结果中不显示该序列，也没有报错。

2021-06-08

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对bwa比对的一些测试中，发现如果参考序列之间有相似时，要输出所有比对结果的话，情况可能不理想。

比如这是参考序列ref.fa：（随意编造的）

>ref1
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATG
>ref2
CTACCGATCTGCACTATAAGCACCCTTATA
>ref3
CTACCGATCTGCACGAACAGCACCCTTATG
>ref4
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATT
>ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG

然后使用同样的序列作为test.fq，就是：

@ref1
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref2
CTACCGATCTGCACTATAAGCACCCTTATA
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref3
CTACCGATCTGCACGAACAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref4
CTACCGATCTGCACTGTAAGCACCCTTATT
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG
+
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF

进行比对：

bwa index -a is ref.fa  # 构建索引
samtools faidx ref.fa  # 构建索引
bwa mem -k1 -T1 ref.fa test.fq > test.sam  # 默认输出结果
bwa mem -k1 -T1 -a ref.fa tmp.fq > test.all.sam  # 比对输出所有结果

默认输出的结果：（候选比对结果会在XAtag中）

使用-a参数输出的结果：（与默认在XA中的相同）

但是直观看的话，比如，ref1输出的比对只有ref1,ref4，直观看ref5也可以（2mis)

==但是，==构建ref时，只使用一个序列，比如只用ref5：

>ref5
CTACCGATCTGCACTATGAGCACCCTTATG

test.fq的文件比对结果则会是：

2023.2.23

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