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单细胞生信分析教程

桓峰基因公众号推出单细胞生信分析教程并配有视频在线教程，目前整理出来的相关教程目录如下：

Topic 6. 克隆进化之 Canopy

Topic 7. 克隆进化之 Cardelino

Topic 8. 克隆进化之 RobustClone

SCS【1】今天开启单细胞之旅，述说单细胞测序的前世今生

SCS【2】单细胞转录组 之 cellranger

SCS【3】单细胞转录组数据 GEO 下载及读取

SCS【4】单细胞转录组数据可视化分析 (Seurat 4.0)

SCS【5】单细胞转录组数据可视化分析 (scater)

SCS【6】单细胞转录组之细胞类型自动注释 (SingleR)

SCS【7】单细胞转录组之轨迹分析 (Monocle 3) 聚类、分类和计数细胞

SCS【8】单细胞转录组之筛选标记基因 (Monocle 3)

SCS【9】单细胞转录组之构建细胞轨迹 (Monocle 3)

SCS【10】单细胞转录组之差异表达分析 (Monocle 3)

SCS【11】单细胞ATAC-seq 可视化分析 (Cicero)

SCS【12】单细胞转录组之评估不同单细胞亚群的分化潜能 (Cytotrace)

SCS【13】单细胞转录组之识别细胞对“基因集”的响应 (AUCell)

SCS【14】单细胞调节网络推理和聚类 (SCENIC)

SCS【15】细胞交互：受体-配体及其相互作用的细胞通讯数据库 (CellPhoneDB)

SCS【16】从肿瘤单细胞RNA-Seq数据中推断拷贝数变化 (inferCNV)

SCS【17】从单细胞转录组推断肿瘤的CNV和亚克隆 (copyKAT)

SCS【18】细胞交互：受体-配体及其相互作用的细胞通讯数据库 (iTALK)

SCS【19】单细胞自动注释细胞类型 (Symphony)

SCS【20】单细胞数据估计组织中细胞类型(Music)

SCS【21】单细胞空间转录组可视化 (Seurat V5)

SCS【22】单细胞转录组之 RNA 速度估计 (Velocyto.R)

SCS【23】单细胞转录组之数据整合 (Harmony)

SCS【24】单细胞数据量化代谢的计算方法 (scMetabolism)

SCS【25】单细胞细胞间通信第一部分细胞通讯可视化（CellChat）

SCS【26】单细胞细胞间通信第二部分通信网络的系统分析（CellChat）

SCS【27】单细胞转录组之识别标记基因 （scran）

SCS【28】单细胞转录组加权基因共表达网络分析(hdWGCNA)

SCS【29】单细胞基因富集分析 (singleseqgset)

SCS【30】单细胞空间转录组学数据库(STOmics DB)

SCS【31】减少障碍，加速单细胞研究数据库(Single Cell PORTAL)

SCS【32】基于scRNA-seq数据中推断单细胞的eQTLs (eQTLsingle)

SCS【33】单细胞转录之全自动超快速的细胞类型鉴定 (ScType)

基于GEO 数据库研究衰老对巨噬细胞(macrophage)亚群的影响

• 背景介绍
  

衰老的特征是持续的促炎症反应的发展，这将导致动脉粥样硬化、代谢综合征、神经变性以及认知衰退等等。随着年龄的增长，认知能力下降和阿尔茨海默病的发病率将越来越高，衰老的大脑也更容易受到某些信号分子的影响。从系统的角度来看，循环系统中的促炎因子可以促进认知能力的下降。而巨噬细胞的发育发展又与促炎因子有着密切关系，因此我们从衰老的角度研究对巨噬细胞的亚群的影响。

巨噬细胞的起源与发育

巨噬细胞（macrophage）这一术语，首次由19世纪末由Elie Metchnikoff提出。通常，巨噬细胞被认为是由骨髓中的造血干细胞→单核细胞发育而来。

经历分化步骤，来到外周血中，成为循环单核细胞，已确定两种：称为“炎症性”和“常驻”单核细胞，主要基于它们在迁移到组织之前在血液中停留的时间。

迁移到组织后，分化为组织特异性巨噬细胞：包括骨骼系统（破骨细胞）、中枢神经系统（小胶质细胞）、肺部（肺泡巨噬细胞）、肝脏（Kupffer cell库普弗细胞）和结缔组织（组织细胞），以及脾脏、胃肠和腹膜。

巨噬细胞的功能

1、吞噬作用

吞噬作用是先天免疫的主要机制之一。巨噬细胞是第一道防线的重要组成部分。先天免疫是指非特异性的免疫，它会攻击任何被认为是外来的东西，这就是为什么它被认为是身体的第一道防线。在感染、炎症或组织损伤期间，它们可以跟随趋化信号迁移到受损的组织/炎症部位，通过称为吞噬作用的过程摄入病原体和细胞碎片，并在吞噬溶酶体中消化它们。

2、巨噬细胞极化的作用

巨噬细胞通常存在于两个不同的亚群：

1)经典激活或M1巨噬细胞，它们是促炎细胞，并被脂多糖(LPS)单独或与Th1细胞因子(如IFN-γ，GM-CSF)联合极化，并产生促炎细胞因子，如白细胞介素-1β (IL-1β)， IL-6, IL-12, IL-23和TNF-α；

2)交替激活或M2型巨噬细胞，具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子IL-4和IL-13极化，产生IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子。

3、抗原提呈

巨噬细胞，还是抗原提呈细胞。巨噬细胞捕获、内吞和表达自身或外来抗原，提呈给其他免疫细胞，作为启动免疫反应的一部分。巨噬细胞还分泌不同的趋化因子和各种强大的物质，影响适应性免疫细胞的激活。

• 数据筛选

•   数据集：

GEO数据库下载GSE120221（Bone marrow R、E和K、N）作为巨噬细胞特异性基因筛选；

• 基因集：通过单细胞数据集筛选基因并作为初筛基因。

涉及到的软件包：

SCS【21】单细胞空间转录组可视化 (Seurat V5)

SCS【6】单细胞转录组之细胞类型自动注释 (SingleR)

SCS【25】单细胞细胞间通信第一部分细胞通讯可视化（CellChat）

SCS【26】单细胞细胞间通信第二部分通信网络的系统分析（CellChat）

SCS【27】单细胞转录组之识别标记基因 （scran）

SCS【15】细胞交互：受体-配体及其相互作用的细胞通讯数据库 (CellPhoneDB)

单细胞转录组学生物信息分析培训内容

第一节 单细胞测序技术与应用

1.单细胞组学技术的发展和原理。

2.单细胞在各个科研领域的应用。

3.单细胞高分文章分析思路解析（细胞群鉴定、拟时序分析、差异表达、功能富集、转录因子、细胞通讯等）。

4.单细胞组学分析常用数据库介绍及使用。

第二节 单细胞组学数据分析实操

1. R语言简介及安装，RStudio的安装及使用说明;

2. R语言语法介绍及常用命令;

3. R语言的数据处理功能及统计应用;

4. GEO数据库使用及数据下载;

5. 数据整理及质控；

6. 从基因表达矩阵开始到marker基因筛选全过程讲解及实操;

7. 通过Seurat软件进行PCA及tSNE降维;

8. 单细胞转录组细胞鉴定及聚类分析;

9. 单细胞转录组差异分析。

第三节 单细胞转录组轨迹、通路、转录因子等分析及绘图实操

1.通过Seurat合并多样本及消除样本异质性。

2. 通过Monocle软件进行单细胞转录组拟时间分析。

3.通过clusterfile网站进行通路富集分析。

4. 通过GSVA计算细胞通路得分信号等。

5.通过cellphonedb进行细胞互作分析。

6. 通过cellchat进行细胞互作分析。

6. 通过inferCNV推断染色体拷贝数变异。

7.通过SCENIC软件进行转录因子预测分析。

第四节 单细胞转录组数据绘图实操生信分析内容

1.GSE120221数据处理及巨噬细胞鉴定

对于下载后的数据利用Seurat进行UMAP降维，去批次话，细胞注释，最后找到巨噬细胞。

2. 根据文章内容，需要作图A,B,E图形，并生成图片。

(A)巨噬细胞亚群显示四个亚群。列出了每个子集的标记基因和组成。

(B)标记基因分析中每个巨噬细胞/单核细胞亚群的标记基因及其富集基因集。典型的M1和M2标记和其他建议的标记的表达。

(E)巨噬细胞/单核细胞亚群相关性分析。

第五节 单细胞生信分析实操结果展示

1.GSE120221数据处理及巨噬细胞鉴定

1). 对数据进行初步的质控注释

进行UMAP的降维聚类，分为0-8个群，结果过如下：

图1 降维聚类结果

2). 对聚类后的结果进行细胞类型注释：

图2 细胞注释结果

3).在巨噬细胞中标记关键基因

利用Seurat中Findmarker对巨噬细胞进行基因标记。

图3 巨噬细胞进行基因标记

4).基于巨噬细胞鉴定的细胞进行单细胞通讯分析

利用软件包cellchat进行单细胞通讯分析，旨在找到细胞通路等。

利用软件包CellPhoneDB进行单细胞通讯分析，旨在找到细胞通路等。

图4 巨噬细胞的细胞通讯分析结果

2. 根据文章内容，需要作图A,B,E图形，并生成图片。 

具体包括内容类似文章分析如下8项：

1). 对巨噬细胞（Monocyte Macrophage）亚群分析

我们利用seurat分析流程对四个样本进行处理，根据singleR对细胞进行注释，筛选出巨噬细胞亚群。然后利用FindClusters函数，resolution参数设为0.2，获得4个巨噬细胞亚群，如图1所示。

图5 巨噬细胞亚群聚类分析

2). 根据标记基因加做巨噬细胞促炎、抑炎亚群比例

我们利用FindAllMarkers函数，结合参数min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25,test.use=wilcox对四个亚型进行标记基因识别。所有marker基因以及对应统计量可见补充材料markers.tsv。我们筛选每个亚型的top5标记基因来可视化表达分布，结果如图2所示。

图6 top5标记基因表达

可以看出左数第一个亚群高表达CD14等抗炎因子，我们命名为AIM (anti-inflammatory macrophages); 第二个亚群高表达HBA1, HBB等血红蛋白相关基因，我们命名为HGM (Hemoglobin related macrophages); 第三个亚群高表达HLA家族白细胞抗原基因，我们命名为HLAM (HLA related macrophages); 第四个亚群高表达IFITM家族泛素促炎基因，我们命名为 PIM (proinflammatory macrophages)。

3). 我们进一步通过热图可视化top5标记基因在不同巨噬细胞亚群中的表达差异，如图7所示。

图7 top5标记基因表达热图

4). 对巨噬细胞四个亚群进行注释之后，我们进一步统计了每种亚群细胞在young和old分组种所占比例，如图4所示。可以发现在young组中，血红蛋白相关巨噬细胞(HGM)明显占比多于old组。相反，在young组中促炎巨噬细胞(PIM)占比明显少于old组。

图8 细胞亚群在不同分组中的比例

5). 绘制标记基因在不同亚群中的基因表达小提琴图

我们进一步利用小提琴图绘制标记基因在不同亚群中的基因表达，如图7所示

图9 标记基因表达小提琴图

6). 图中横轴4种颜色标记了4个巨噬细胞亚型，纵轴代表基因表达。我们进一步利用散点图可视化标记基因在所有巨噬细胞中的表达分布情况，如图8所示。

图10 标记基因featureplot

7). 对标记基因进行GO功能注释

我们识别了每个细胞亚群对应的标记基因，接下来我们利用clusterprofiler R package对每个细胞亚群的标记基因分别进行gene ontology功能富集分析。

图11. top10 go terms of AIM

图12. top10 go terms of HGM

图13. top10 go terms of HLAM

图14. top10 go terms of PIM

8). 典型的M1和M2 maker和其他maker的标记的基因表达

我们利用小提琴图展示M1/M2型巨噬细胞marker和其他marker基因的表达情况，如图13所示。

图15 canonical markers violingraph

9). 标记基因在巨噬细胞中的表现

我们利用featureplot可视化M1/M2型巨噬细胞marker和其他marker基因在巨噬细胞中的表达分布。

图16. canonical markers featureplot

10). 巨噬细胞/单核细胞亚群相关性分析

我们筛选出1000个方差最大的基因作为特征，结合speaman相关性分析比较四种巨噬细胞亚群之间的相关性，结果如图15所示

图17. 细胞亚群相关性

References:

1. Minhas PS, Latif-Hernandez A, McReynolds MR, et al. Restoring metabolism of myeloid cells reverses cognitive decline in ageing. Nature. 2021;590(7844):122-128. doi:10.1038/s41586-020-03160-02.

2. Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A, et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 2017;169(7):1276-1290.e17. doi:10.1016/j.cell.2017.05.018

3. Li X, Dai Z, Wu X, et al. The Comprehensive Analysis Identified an Autophagy Signature for the Prognosis and the Immunotherapy Efficiency Prediction in Lung Adenocarcinoma. Front Immunol. 2022;13:749241. Published 2022 Apr 22. doi:10.3389/fimmu.2022.749241

4. Hu C, Chu C, Liu L, et al.Dissecting the microenvironment around biosynthetic scaffolds in murine skin wound healing. Sci Adv. 2021;7(22):eabf0787. Published 2021 May 26. doi:10.1126/sciadv.abf0787

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