2022-01-20

Nat Bio | 构象锁定抗体“钳夹”用于KRAS抑制剂的发现

原创 苏安 图灵基因 2022-01-20 09:12

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：苏安

IF：54.908

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亮点：

对于药代动力学中难以处理的蛋白质问题，稳定非活性蛋白质构象的小分子是一种未被充分利用的策略。为了便于这类抑制剂的发现和表征，研究人员创建了一个筛选平台来识别分子探针(CLAMPs)的构象锁定抗体，以区分和诱导罕见的蛋白质构象状态。将该方法应用于KRAS，研究人员发现了识别由共价抑制剂稳定的KRASG12C的开放构象的clamp。一个钳夹可以在体内显示KRASG12C共价修饰，并可用于研究患者肿瘤中对KRASG12C抑制剂的反应异质性。第二个钳夹通过稳定KRASG12C的特定构象，增强了与KRASG12C开关II区域(SWII)结合的弱配体的亲和力，从而能够发现这些配体，可以作为高通量筛选药物开发的先导。研究表明，结合抗体和小分子的互补特性有助于动态蛋白的研究和用药。

 

蛋白质通常以一系列构象状态的形式存在来执行其功能，扰乱这些构象也可能会导致疾病。小分子抑制剂能够捕获这些动态蛋白质，为许多疾病提供了潜在的治疗方法，但由于蛋白质固有的构象灵活性，这些小分子抑制剂的发现仍然具有挑战性。小分子抑制剂需要与动态的蛋白质发生高亲和力的结合才有效，但文库筛选的策略难以筛选到高亲和力的小分子抑制剂。合成单克隆抗体(mAbs)是一种新兴的工具，可以稳定独特的蛋白质构象，并提高构象锁定靶点结合的能力，从而能够发现针对RAS、caspases和GPCRs1-5的构象传感器。然而，因为没有能够锁定特定构象的小分子，并且还没有强大的工具将其整合到单抗中，所以这些单克隆抗体仍然罕见。

近期，在Nature Biotechnology杂志上发表了一篇名为“Conformation-locking antibodies for the discovery and characterization of KRAS inhibitors”的文章，本文的研究人员建立了一个抗体平台来识别构象锁定抗体的分子探针，他们称之为钳夹。研究人员将该平台应用于共价修饰的KRASG12C中，发现了两类CLAMPs。其中一种钳夹可以在单个癌细胞和肿瘤中检测共价修饰的KRASG12C，为KRASG12C抑制剂介导的靶点参与提供了一个直接的生物标记物，并可以与RAS通路标记物结合，在细胞水平上评估通路抑制和随后的反弹。其他claps也表现出对KRASG12C-GDP的亲和力，在没有配体的情况下，一个钳夹稳定SWII口袋的开放构象。这一特性大大提高了多种非共价抑制剂对KRASG12C和KRASWT的亲和力，并使通过高通量筛选发现新的SWII口袋配体成为可能。研究人员认为KRAS CLAMPs是研究KRASG12C共价修饰的重要生物学和药物发现工具，将为识别靶向KRAS SWII口袋的化学物质提供一个独特的平台。

为了发现KRAS SWII口袋的CLAMPs并且对其进行特性分析。作者开发了一种利用合成抗体库的体外选择策略来鉴定KRAS CLAMPs的方法。并将这种方法应用于KRAS，KRAS在其switI(SWI)和SWII区域表现出构象异质性，以识别能够稳定与KRASG12C共价抑制剂诱导的开放SWII口袋构象兼容的抗体。为了鉴定KRAS CLAMPs，作者利用了KRASG12C的不同构象：未修饰的KRASG12C-GDP、KRASG12C-GDP与共价抑制剂和KRASG12C-GMPPCP(不可水解的GTP模拟物)，进行了4轮生物筛选。为了驱动形成共价抑制KRASG12C-GDP的独特构象，作者在溶液中存在过量的KRASG12C-GDP和KRASG12C-GMPPCP的情况下进行选择。为了发现能够在没有抑制剂的情况下稳定开放SWII口袋构象的抗体，作者还用KRASG12C-GDP+GNE-1952进行了三轮筛选，然后用KRASG12C-GDP进行了第四轮筛选。通过噬菌体酶联免疫吸附试验确定特异性，作者生成了11个独特克隆的IgGs，并通过ELISA和表面等离子体共振对其结合特异性进行了表征。图1.KRAS CLAMPs的发现和表征

由于与KRASG12C-GDP相比，1A5钳对共价修饰的KRASG12C-GDP具有最高的特异性，为了追踪细胞中的KRASG12C共价修饰，我们检测了1A5钳是否能特异性检测细胞中抑制剂结合的KRASG12C。免疫荧光染色1A5钳检测各种KRASG12C共价抑制剂，包括GNE-1952，ARS-853，ARS-1620和AMG510，从而证实了1A5识别各种KRASG12C共价抑制剂诱导的共同三维表位的能力。ARS-1620处理的HCC1171细胞中的1A5钳染色强度似乎与剂量和时间有关，与共价抑制KRASG12C的免疫印迹结果一致。免疫荧光染色的结果显示，细胞中KRASG12C的ARS-1620共价修饰在细胞的质膜和点状隔间中均以相当同步的方式发生。由于不存在RAS-GDP特异性抗体，1A5钳夹染色可能提供了KRASG12C-GDP在细胞中的定位信息。此外，1A5钳位染色的均匀性和动力学表明，KRASG12C的共价修饰可能与细胞周期阶段无关。由于KRASG12C-GDP的共价修饰依赖于内在的GTP水解，这些发现进一步表明，内在的KRASG12C-GTP水解也不依赖于细胞周期，并且突出了1A5钳检测共价修饰KRASG12C-GDP的敏感性。图2.1A5钳可以在多种细胞检测中监测KRASG12C共价修饰

作者还调查了一套市售的KRAS抗体，以确定其构象特异性。他们通过免疫沉淀和ELISA鉴定了两种与KRASG12C亲和力相当的抗体(EP1125Y和Ras10)，无论是否进行共价修饰，表明这些抗体对共价修饰诱导的构象没有特异性。相比之下，据报道对HRAS-GTP具有高度特异性的iDab抗体很少或没有与共价修饰的KRASG12C-GDP结合，但通过ELISA与KRASG12GC-GDP和KRASG12C-GMPPCP结合和免疫沉淀研究。由于iDab抗体结合了一个同时跨越SWI和SWII区域的表位，由KRASG12C-GDP共价修饰诱导的SWII构象可能阻止了iDab的结合。因为1A5钳和iDab的互补特异性，作者为了确定1A5钳和iDab抗体是否可以联合用于协同使用，并在同一细胞内观察未修饰和共价修饰的KRASG12C。他们对经ARS-1620剂量滴定处理的HCC1171 KRASG12C细胞进行了1A5钳夹和iDab抗体的IF实验。与之前使用1A5进行的IF实验相似，作者检测到1A5染色的增加，这与高浓度的ARS-1620处理相关。此外，1A5染色增加与iDab抗体染色减少相一致，证实了这两种抗体染色出的KRASG12C构象不同。作者将两种抗体共染色，监测到KRASG12C的重新合成。药物洗脱后，免疫印迹分析显示，修饰的KRASG12C早在6小时就明显出现，并在24h时增加，1A5染色显著，减少，IF显示iDab抗体染色增加。图3.一种使用1A5钳夹的双抗体检测和一种文献抗体同时跟踪未结合和共价修饰的KRASG12C

接下来，作者试图确定1A5钳夹是否可以在人肿瘤异种移植实验中检测到共价修饰的KRASG12C。他们使用福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组化检测1A5钳共价抑制KRASG12C，结果显示阴性，这可能是由于福尔马林处理破坏了1A5钳识别的构象表位。然而，ARS-1620共价修饰的KRASG12C很容易在未固定的新鲜冷冻组织中被IHC检测到。此外，研究人员观察到，与50mgkg-1处理相比，100mg-1处理的样品染色更强的染色趋势。通过1A5钳夹，也可以检测到表达由ARS-1620共价修饰的少量KRASG12C的肿瘤。

与体外细胞实验类似，1A5钳在体外肿瘤样本的荧光激活细胞分选仪实验中，检测到被ARS-1620共价修饰的KRASG12C，并可与pS6结合。这些结果表明，在KRASG12C突变肿瘤样本中1A5钳可以测量KRASG12C抑制剂的直接靶点接触，并且利用RAS通路激活标记物进行单细胞分析。图4.KRAS钳可以检测经ARS-1620处理的高、低表达和低KRASg12c的小鼠异种移植物中共价修饰的KRASG12C

为了对钳夹复合物CLAMP-KARSg12c进行结构分析。作者测定了KRASG12C-GDP与2H11片段抗原结合(Fab)复合物的晶体结构是2.2a分辨率的。结果表明，2H11Fab不是与KRASG12CSWII口袋结合，而是接触SWII区域的外表面，以变构的方式稳定口袋的开放构象。2H11Fab互补决定区(CDRs)H1和H3参与了与KRASG12C的大部分直接接触。CDRL2和H2也提供了一些与KRAS的范德华接触。CDRL2接触到SWII螺旋的n端尖端，为SWII环提供了额外的稳定，但没有过度限制SWII的构象。SWII最灵活的部分Gln60-Ala66完全不与2H11直接接触，保持了口袋内的灵活性。SWII口袋具有稳定的、开放的构象，类似于之前发表的与配体结合的KRAS结构，这表明配体很容易结合。图5.2H11钳夹稳定SWII口袋，并结合多个KRAS突变蛋白。

鉴于2H11可以稳定SWII口袋并显著增强弱配体的结合，我们推断这种钳夹将使KRASG12C-GDPSWII口袋的片段先导发现。我们筛选了在2H11存在下的3060个化合物的片段库，用KD<1、500μM鉴定出了其中3.3%的化合物。其中三分之一的化合物在2H11的存在下显示出KD<500μM。此外，在2H11存在的情况下，片段筛选导致的总命中率增加了两倍，而KD<500μM的片段数量增加了13%，突出了2H11钳位能够发现弱配体的能力。然后，我们测定了在2H11的情况下，GNE-2897和GNE-9764对KRASG12C的亲和力。在2H11存在下，GNE-2897和GNE-9764对KRASG12C的结合亲和力在KD=600和1,200μM之间相比之下，在没有2H11的情况下，两种配体对KRASG12C都没有任何显著的亲和力。接下来，我们求解了GNE-2897与KRASG12C-GDP-2H11结合的晶体结构。我们发现GNE-2897结合在SWII口袋的后面，该位点通常被共价抑制剂占据。值得注意的是，GNE-2897与最近发表的一种有效的KRASG12C-GDP共价抑制剂相似，表明2H11钳夹可用于识别新的、不同的片段，这些片段可以进一步优化成新的引物。图6.2H11钳夹可以发现弱亲和力的SWII配体

作者通过生物学和物理结构的结果表明，2H11钳可以在KRASG12C-GDP中诱导具有SWII口袋的开放构象，可以提高SWII配体的亲和力，并可能使未来在KRAS突变体中更广泛地靶向该口袋。尽管取得了这些成功，但其他KRAS突变体是否可以通过SWII口袋进行靶向仍有待确定。这些研究揭示了KRAS共价修饰的新见解，并可用于在细胞和体内肿瘤模型中可视化和跟踪抑制剂结合的KRASG12C。这些发现对于动态蛋白的药物研究具有重要的意义。

教授介绍：

Marie Evangelista

Marie Evangelista,肿瘤学首席科学家，博士后导师。2003年在加拿大皇后大学获得博士学位，2004年加入Genetech担任博士后研究员，2009年被聘为首席科学家。Genetech是世界上为数不多的进行突破性基础科学研究并将这些知识转化为药物的研究所之一。Marie Evangelista的工作是专注于肿瘤学中一些最具有挑战性且重要的目标，主要包括细胞周期检查点，肿瘤靶向药物，细胞应激等研究。

参考文献：

Marie Evangelista, et al. Conformation-locking antibodies for thediscovery and characterization of KRAS inhibitors [J].Naturebiotechnology. 2022 Jan 7: