2018-10-14 测序基本知识

1##一代测序
sanger测序，双脱氧核苷酸ddNTP会结合所有位点，
设置四个反应体系1-4，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP、一定比例的ddNTP（带有放射性标记）ddATP遇到了T位点，就结合并终止
准确性高达99.999%
2##二代测序
第二代DNA测序技术(next generation sequencing，NGS )-循环阵列合成测序法。
主要特点高通量

Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生
Illumina：Hiseq（Pair End双端）
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
第一步： 构建DNA文库
第二步： 上样 【重点搞清楚lane上有哪两种接头，待测序列含有哪两种接头，这很重要！】
第三步：桥式PCR
第四步：测序

3##三代测序
　第三代测序技术以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术为标志，不需要经过PCR扩增，超长读长，可达二代测序的100倍以上，实现了对每一条DNA分子的单独测序。错误率比二代要高，达到10-15%。