贝类包纳米虫病诊断方法
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242 g
57.1 mL
100 mL
1000 mL
A.9 1× 电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容至
室温贮存。
A.10 苏木精染液的配制方法
苏木精
无水乙醇
硫酸铝钾
蒸馏水
氧化汞
冰乙酸
20 mL
1000 mL
1g
10 mL
20 g
200 mL 0.5 g
8 mL
分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加
热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。
A.11 伊红染液的配制
选用水溶性伊红。配方为：伊红1g、70%～75% 酒精100 mL、
伊红用少许蒸馏水调成耀糊状，再加
入酒精，边加边搅拌，直至彻底溶解，此时试剂有些浑浊，取0.1 mL
冰乙酸，加入试剂中，试剂逐渐转变
为清亮，呈鲜红色。
A.12 返蓝液的配制
取 5 mL 氢氧化氨，加入1000 mL 蒸馏水中即可。
A.13 石蜡切片制备
A.13.1 组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片
取材固定24 h,修整组织块，换固定液重新固定12 h, 自来水冲洗24 h、70% 乙 醇
1 h、85% 乙醇 1h、95% 乙醇45 min 2 次，无水乙醇30 min3 次，二甲苯30
min,二甲苯5 min～20 min 2 次，放入石蜡
1h~1.5h2 次，然后包埋，并修片，切片，展片，贴片，烤片。
A.13.2 切片水化、染色、水洗、脱水、复染及封片
二甲苯10 min 2
次，然后依次通过无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2
min,再
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通过蒸馏水3min 后，苏木精染色5 min～20 min,自来水洗3 min,1% 盐酸酒精8
s～15 s,自来水洗 3 min后，返蓝液2 min～5 min,自来水5 min,蒸馏水5
min,然后依次通过50%乙醇、70%乙醇、80% 乙醇各3 min
进行脱水，0.5%伊红染液复染1 min～2min,
再依次通过95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、
无水乙醇各2 min 进行二次脱水，二甲苯透明2 min 2次，最后用封片树胶封片。
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附 录 B
(资料性)
贝类包纳米虫病
B.1 疾病描述
包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫(Bonamia ostreae)、杀蛎包纳米虫(Bonamia
exitiosa)等在宿主血
细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或外套膜中而引起的水生动物的一种血液原虫病，是严重危
害世界贝类养殖业的主要疾病，也是世界动物卫生组织(WOAH)
规定的检疫性贝类寄生虫病。
B.2 病原
现发现的包纳米虫包括5个种，除主要寄生在欧洲平牡蛎(Ostrea
edulis)体内的牡蛎包纳米虫 (Bonamia
ostreae)外，还有寄生在悉尼岩牡蛎(Saccostrea
glomerata)体内的鲁夫来包纳米虫 (Bonamia roughleyi)、欧洲平牡蛎(Ostrea
edulis)体内的杀蛎包纳米虫(Bonamia exitiosa)、近江牡蛎 (Crassostrea
ariakensis)体内的成孢包纳米虫(Bonamia
perspora)、澳大利亚安加西牡蛎(Ostrea an-
gasi)体内的包纳米虫未定种(Bonamia
sp.)。该病原的感染力较强，含有该病原的悬液具有传染性，使
其在寄主细胞内定位接触30 min
即可感染牡蛎，其中以颗粒血细胞中的病原感染力最强。造成广泛危
害的主要为牡蛎包纳米虫和杀蛎包纳米虫。
B.3 易感宿主
易感宿主包括欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)、安加西牡蛎(Ostrea
angasi)、帕尔希牡蛎(Ostrea puel- chana)、 智利牡蛎(Ostrea
chilensis)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)、智利鹑螺(Tiostrea
chilensis)
等贝类。
B.4 临床症状
牡蛎感染包纳米虫病后通常表现为双壳闭合不全，严重时出现鳃丝损伤或死亡，但该症状也可能由
其他疫病引起，并不能通过症状来判定是否感染了包纳米虫病。轻症则无明显症状。
B.5 地理分布
本病主要分布在丹麦、荷兰、法国、爱尔兰、英国、意大利、西班牙、美国。欧洲和南美洲都曾有牡蛎
包纳米虫感染欧洲平牡蛎引起死亡的报道。近十几年来，牡蛎包纳米虫病的流行趋于缓和，虽未出现重
大的流行，但在美国、英国、爱尔兰、加拿大等地时有发生，流行率从百分之零点几到百分之三四十不等。
我国目前尚未有水生动物包纳米虫病发生的报道。
B.6 组织印片检查
包纳米虫呈球形或卵圆形，虫体大小为2μm～5μm,
细胞核红染，细胞质蓝染，多寄生在细胞内。
包纳米虫见图 B.1 中箭头所指位置。
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图 B.1 组织细胞内的包纳米虫
B.7 血淋巴印片检查
在显微镜下可观察到虫体寄生于血淋巴细胞内，呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm,
姬姆萨染
色后，细胞核红染，细胞质蓝染。包纳米虫见图 B.2 中箭头所指位置。
图 B.2 牡蛎血液中的包纳米虫
B.8 组织病理学检查
包纳米虫呈球形或卵圆形，虫体大小为2μm～5μm,
细胞核红染，细胞质蓝染。包纳米虫见图 B.3
中箭头所指的位置。
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图 B.3 牡蛎石蜡切片中包纳米虫的观察
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附 录 C
( 资 料 性 )
目标扩增序列及引物 、 探针的位置
C.1 Bonamia ostreae 的 PCR 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 位 置 ( 3 0 0 bp)
CATTTAATTGGTCGGGCCGCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTCAAA
Bon F
GCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGG’AATAATAAGACACGACTTCGGC|GCICGCCT|CGGC
G
GTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGGGGGTGCTAGTA
TCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATGCGAAAGCATTC
ACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTT GGGGGATCGAAGACGATCAG
Bon R
注：斜体带下划线的GGCGCC 为 Hae Ⅱ 酶切位点，“口”中的GCCGCCTCGGC
为 Bgl I 酶切位点，“ | ”表示酶切位 点的酶切位置。对特异性引物 Bon F
和 Bon R 的 PCR 扩增产物进行 Hae Ⅱ 和 Bgl I 酶切分析，Bonamia os-
treae 、Bonamia exitiosa 和 Bonamia perspora 被限制性内切酶 Hae Ⅱ
酶切为115 bp 和189 bp;Bonamia
ostreae 被限制性内切酶 BglI 酶切为120 bp 和180 bp,Bonamia exitiosa 和
Bonamia perspora 不能被酶
切，以此确定其种属。
C.2 Bonamia exitiosa 的 PCR 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 位 置 ( 3 0 4
bp)
CATTTAATTGGTCGGGCCGCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTC
Bon F
AAAGCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGGAATAATAAGACACGACTTCGGCGC|CGC
CTCTCGTGGC GGTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGG
GGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATG
CGAAAGCATTCACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTT GGGGGATCGAAGACGATCAG
Bon R
C.3 荧 光 PCR 的 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 探 针 位 置 ( 9 2 bp)
GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTG
GGGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTA
Bon qF Bon qP
AAAT TCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATG
Bon qR
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