Paper 2：转录组+miRNA+降解组相关文章

Paper 2：转录组+miRNA+降解组相关文章

标题：Integrated transcriptome, small RNA and degradome sequencing approaches provide insights into Ascochyta blight resistance in chickpea

Plant Biotechnology Journal

doi: 10.1111/pbi.13026

Vanika Garg1,2, Aamir W. Khan1, Himabindu Kudapa1, Sandip M. Kale1, Annapurna Chitikineni1, Sun Qiwei3,Mamta Sharma4, Chuanying Li3, Baohong Zhang5, Liu Xin3 , P.B. Kavi Kishor2 and Rajeev K. Varshney1,*

Summary

Ascochyta blight AB枯萎病是限制全国范围的鹰嘴豆的产量的主要生物胁迫因素。为了剖析鹰嘴豆抵抗AB的复杂机制，使用转录组，small RNA 和降解组测序方法。

1. 在两个时间点（接种第3天和第7天）,在控制和胁迫的条件下，对20种样品的转录组进行了测序，包括两种抗性基因型、两种易感基因型和一种渗入型，共鉴定出6767个表达差异基因DEG。
2. 这些DEG主要与发病相关的蛋白、抗病基因，如NBS-LRR，细胞壁生物合成和各种次生代谢合成基因有关。
3. 样品的small RNA测序结果鉴定出651 miRNAs，其中包括478个已知的miRNAs，173个新miRNAs。在不同基因型、状态和时间点，共有297个miRNA差异表达。
4. 使用降解组测序和计算机方法，预测了629个miRNAs的2,131靶标。
5. smallRNA和转录组数据结核确定了在抗性和易感基因型中表现相反的表达，并且在AB感染期间可能转录后沉默的基因子集的 12个miRNA-mRNA相互作用对。
6. 这项研究的综合性分析the comprehensive integrated 为鹰嘴豆胁迫相关的转录动力学和调控网络分析提供了更好的简介，且为鹰嘴豆的改良提供了候选基因。

Result

Transcrptome sequencing

在这项研究中，20个样品代表两个温和的抵抗基因型(ICCV 05530 and ILC 3279)，两个易感基因型 (C 214 and Pb 7)和一个渗入品系（BC3F6)，在两个接种时间点进行测序。20个样品的paired-end sequencing 共产生了1.351亿个reads。严格的质量过滤后供进一步分析，再比对到鹰嘴豆的基因组，并对基因按照基因型和时间条件进行命名。

Differential gene expression analysis

1. 差异基因表达汇总

   为了研究差异基因的表达情况，过滤掉低质量的表达基因（FPKM>=1，且定量状态为ok），发现一个样品中至少表达了21,527个基因。过滤掉低表达基因，使用Cuffdiff 计算34成对组合中的基因倍数的变化。总共发现6,767个基因在每两个样品间显示出明显的差异表达。

   在BC₃ F6-C-3d :Pb ₇-C-3d=Star 284 (183 up-regulated; 101 down-regulated):Over 2607 (953 up-regulated; 1654 down-regulated)

   在AB感染后，第3天的下调趋势更加明显，第7天则发现每种基因型中更多的基因被上调

   在对照条件下，从不同基因型中鉴定出大量的DEG，在第3 dpi时ILC 3279与Pb 7之间的DEG数量最多（901上调； 255下调255），而ILC 3279与C 214之间的DEG最高（812上调； 1290下调）在第7 dpi（图1b）。

   同样，在感染后，在第3 dpi时发现ILC 3279和Pb 7（上调811；下调581）之间的最大DEG，在第7处ICCV 05530和C 214（上调953；下调1654）之间发现最大DEG。 dpi（图1c）。

   可以看出，每种组合的DEG大部分都是唯一的。

   这些结果表明，鹰嘴豆中真菌感染后基因型和阶段特异性反应。

2. GO富集分析

   在6,767个重要的DEGs中，使用blastx注释了5,309个基因，并GO将其分配给4,559个基因，共获得10,962个GO项。

   可以看出，DEG的GO分配给 the biological process (3632), molecular function (3744) 、 cellular component (3586) .

   对DEG的GO富集分析表明，

   在生物过程类别项目下，显著的terms是：oxidation-reduction process (GO:0055114), regulation of transcription (GO:0006355), defense response to fungus (GO:0050832), response to chitin (GO:0010200), response to salicylic acid(GO:0009751), response to jasmonic acid (GO:0009753), response to abscisic acid (GO:0009737),ethylene-activated signaling pathway (GO:0009873) 、response to auxin (GO:0009733)

   在分子功能类别中，显著的terms是：ATP binding (GO:0005524), protein serine/threonine kinase activity (GO: 0004674), oxidoreductase activity (GO:0016491), peroxidase activity (GO:0004601), hydrolase (GO:0016787) and monooxy genase activity (GO:0004497)

   在细胞成分类别中，最为丰富的是： plant-type cell wall (GO:0009505), apoplast (GO:0048046) and anchored component of membrane (GO:0031225)

   显著丰富的GO项目进一步聚类以获得高度连的clusters。

   这个F 2a，也是GO的富集性差异基因的图，可考虑换个方式作图。

3. KEGG差异基因通路

   此外，为了理解分子机制，使用KEGG进行了DEGs分子途径分析。发现DEGs共代表134条途径。

   富集分析表明，在AB感染下，最富集的途径是：metabolic pathways (ko01100), biosynthesis of secondary metabolites (ko01110), plant hormone signal transduction (ko04075) and plant-pathogen interaction (ko04626)

   4.在该项研究中，891个transcription factor（TF） encoding genes 属于50个基因家族。

   其中，代表最多的TF家族是 bHLH (91), ERF (90), MYB (75), NAC (68) and WRKY (65) ；并且达县大量的其他TF家族（如C2H2，bZIP和MADS）在应激条件下显示出不同的表达模式；

   研究了在应激条件下所有基因型中10个最富集的差异表达特异性。可以看出，在第7天时，所有基因型中差异表达的TF编码基因的数量都更高。且抗性基因型比易感基因型差异表达的WRKY成员的数量相对更多。

   例举相关的文章和其中类似的结果进行陈述。

Expression trends across the chickpea genootypes under control and stress conditions

​ 防御反应设计植物中大量的转录重编程，使用聚类分析，确定了不同时间点和易感基因型具有相似表达趋势的基因，其中相似表达谱，DEGs分为六个主要clustered。

1. 在控制条件下，抗性基因型上调趋势更为深刻。clusterI 由第3dpi或者第7dpi显示抗性基因型诱导表达的基因组成。这些基因的GO富集表明，大多数基因参与了salicylic acid, metabolic process, oxidation-reduction process, flavonoidbiosynthetic process and response to biotic stimulus。并且，抗病基因簇重要组成成员为chitinases (Ca_04405), CC-NBS-LRR (Ca_08361) and dirigent protein (Ca_20726)。

2. 在对照条件下，另一个clusterII，在第3或者第7dpi显示抗性基因型中的基因表达收到限制。这些基因主要与auxin, catabolic process, oxidoreductase activity, heme binding and xylan acetylation有关。其中包括生长素响应原件，与同源异型相关的TF和类似的ERF和Dof在这个TF群中。

3. 另外，当鹰嘴豆暴露于AB胁迫下时，观察到第3dpi和第7dpi显示诱导表达的cluster III。该簇 III主要包括pathogen recognition and defense response，如leucine-rich receptor-like kinase, NBS-LRR proteins, oxidation-reduction process, cuticle development and fatty acid biosynthesis。

4. Cluster IV 包括在第3dpi抵抗型基因中显著上调的基因，该簇主要包括pathogen recognition and defense response like leucine-rich receptor-like kinase, NBS-LRR proteins, oxidation-reduction process, cuticle development and fatty acid biosynthesis。

5. Cluster IV在第3dpi抵抗型基因型中显著上调的基因。包括：defense response to fungus, chitin catabolic process, signal transduction, peroxidase activity and oxidation-reduction process. A number of stress-responsive genes like pathogenesis-related (PR) proteins, chitinases, Kunitz-type trypsin inhibitor, glutathione-S-transferase (GST), TIR-NBS-LRR, and dirigent proteins along with TFs like bHLH, WRKY and MYB were a major part of this cluster。观察到，与易感基因型相比，编码抗病反应蛋白DRRG49-C (Ca_02987) 在所有抗性基因型上均表现出5.5倍的平均log₂。并且发现该簇许多基因在第7dpi不耐性基因型时显著被抑制。包括几个应激反应基因，如，dirigent, syntaxin, COBRA, Kunitz-type trypsin inhibitor and aquaporins。

6. Cluster V 在抗性基因型中仅在第7dpi显示出调控的基因组成。该簇包括与细胞壁生物合成有关的基因，包括：cellulose synthase (Ca_08607), cell wall loosening like expansin and ion homeostasis including Nramp5 (Ca_25717)。

7. Cluster VI在第3dpi和第7dpi表现出易感基因型的诱导表达。该簇基因主要涉及 defense response, proteolysis, response to abscisic acid, response to salicylic acid, hydrolase activity, jasmonic acid and ethylene mediated signaling pathway, protein phosphorylation and leaf senescence.诸如：senescence-associated protein (Ca_10582), accelerated cell death 11 (Ca_08010), desiccation�related protein (Ca_08076), jasmonate O-methyltransferase (Ca_04771), leucoanthocyanidin dioxygenase-like protein (Ca_17705), pectinesterase (Ca_20384) and calcium-transporting ATPase (Ca_12185) and TFs encoding for NAC, MYB and ERF were up-regulated in susceptible genotypes。有趣的是，该簇的大多数基因，衰老相关和加速细胞死亡蛋白，在易感基因型中在第3dpi中受到限制，并在第7dpi中受到诱导。

High-throughput small RNA sequencing

为了鉴定鹰嘴豆中与AB胁迫相关的miRNA，共构建了20个小RNA文库并进行测序。总共产生了5.328亿reads，每个样本平均产生2600万次。在过滤低质量读数并进行修整后的后续步骤之后，保留了5.172亿高质量读数集，用于进一步分析。丢弃了大约6000万条长度小于18nt或者大于35nt的读段，除去定位的重复序列以及ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) and small nucleolar RNA (snoRNA) 。unique small RNA reads 指出24nt（51.2%）最丰富的类别，23nt和22nt其次。

例举相似文献高表达在24nt。 implies the abundant representation of endogenous siRNAs in all the samples analyzed, in concurrence with previous studies

Identification of known and novel miRNAs

为了鉴定鹰嘴豆中conserved/known miRNAs，对miRBase中其他物种的miRNA过滤后reads中，共有1,120万条reads被定位到miRBase，从而在所有样品中坚定了478个unique conserved。除了conserved miRNAs，植物还具有物种或者谱系species-或者lineage-特定的新型miRNA。因此，对无法匹配的miRBase reads 进行了novel miRNAs预测。通过miRDeep-P 软件处理了总共42万条未错配的鹰嘴豆基因。简而言之，将匹配的reads延伸获得precursor reads（使用Vienna 包进一步折叠成潜在的stem-loop结构的precursor reads ）。过滤并处理characteristic miRNA precusor 二级结构。在去除不符合植物miRNA标准且样品中少于10reads的miRNA，最终获得了173个unique miRNA。

1. miRNA总数范围从Pb7-C-7d的339个到BC3F6-S3d中的471个。长度范围在20-24nt，其中丰度最高的是21和24。The 20–24 nt length of miRNAs is in agreement with the products of DCL cleavage activity (Reinhart et al., 2002).

   评价了成熟的miRNA候选的核苷酸组成，发现大多数长度在21nt的miRNA多数组成由50个尿苷残基。且，许多植物都观察到21nt的长度的miRNA存在50个尿苷酸残基，这是DCL1裂解和AGO1的特征属性。

2. 鹰嘴豆的miRNA平均GC含量在48%，这个与紫花苜蓿（44%），拟南芥（45%），大豆（46%），葡萄树（%）的GC含量相似。

   基于相似性，已知的miRNA聚类将它们分成240个家族，其中miR166家族最大，有46个成员，其次miR156（44）和miR171（33）。

3. 此外，发现有5个novel miRNAs聚类成conserved miRNAs ，这些miRNA肯呢个构成了最新进化的的conserved families。

Differentially expressed miRNAs during AB infection

为了区别对AB有反应的miRNA,对鉴定出的miRNA在文库中的表达模式进行了研究。

大多数已经鉴定的miRNA至少在一个样品中已经表达。在本研究中，297个miRNA在不同的组合中显示出显著表达差异模式，大多数miRNA在压力条件下显示出下调趋势。

1. 大量的miRNA以基因型和阶段特异性方式表达差异。在胁迫下，约有25%的差异表达miRNA在第3dpi和44%的miRNA的第7dpi是基因型特性。例如，For example, miR156h-3p was highly induced (average log2 fold change 4) at both 3rd and 7th dpi specifically in ILC 3279 genotype

2. 此外，为了查询miRNAs与AB抗性有关的miRNA,通过比较在胁迫下的抗性和易感基因型，研究了包括渗系在内的所有抗性基因型表现出相似的表达模式的miRNA。

   结果显示，耐药基因型中第3和第7dpi三个novel miRNA(nov_miR3a, nov_miR64,nov_miR171) 显示上调。在第3dpi和第7dpi，总共7中miRNA包括抗性基因显示下调（miR3627b, miR2111l, miR2111-3p, miR1507b, nov_miR123, miR166i-5p and nov_miR81）。在第7dpi时，miRNA下调的趋势更加明显。共有8和21个miRNA在抗性基因型中分别在第3和第7dpi特异下调。同样，

……

太多了，写不完，不写了。:sweat_smile:

Target predition via in silico and degradome approaches

植物miRNA使用silico通常具有完美或接近完美的互补性。使用psRNATarge server,我们确认了总共593个（已知的429个已知和164个新miRNA）可识别1735个靶标。

此外，使用降解组测序，共产生了1.458亿个序列reads，平均每个样品有1,460万个reads。经过连续过滤步骤，获得了1.344亿reads，这些读数已被用于鉴定切割位点。

1. 为了清晰分析，样品指定为基因型条件。例如，在对照条件下，ILC 3279-C 代表ILC 3279 。在每个样品中，平均鉴定出P<=0.05，类别<=4的non-redundant 目标。确定了最大targets为 ILC 3279-C (201)，最小为Pb 7-C (151)。对于每个样品，最大切割位点属于类别0（平均41.4%），最小切割位点为类别4（平均12.7%）。这些切割位点以靶标图（target plots）（T-plots）表示。

2. 使用降解组测序，我们鉴定出407（已知324个和83个新颖的）miRNA确定552个靶标。

   通过silico和降解组分析，几乎所有（96.6％）miRNA均被鉴定出2131个靶标。

   可以看出，针对miR396家族（148）获得最大八点，其次为miR(106)、miR156(80)。对靶标的注释信息表明，他们主要属于TFs, phytohormones, stress-responsive genes, disease resistance genes like NBS-LRR, cellular enzymes like kinases, reductases and phosphatases。（TF靶标的mRNA转录本也代表了相当一部分的miRNA靶标。）总共确定了属于35个家族的192个TF。最大的靶标来自于MYB（17.2%)，其次的bHLH (7.8%) and ARF (6.8%)。

3. 进一步进行GO富集分析，以阐明miRNA靶标在鹰嘴豆中应对AB胁迫的潜在作用。这些靶标被同一分配给1,470个生物过程，1,477个细胞成分和1,503个分子功能。

   其中丰富的生物学过程包括：RNA modification (GO:0009451), plant-type secondary cell wall biogenesis (GO:0009834), defense response (GO:0006952), response to jasmonic acid(GO:0009753), signal transduction (GO:0007165) and response to salicylic acid (GO:0009751)。

   在分子功能中，最重要的GOterms为endonuclease activity (GO:0004519), miRNA binding (GO:0035198), oxidoreductase activity (GO:0016722) and xylan O-acetyltransferase activity (GO:1990538)。

   在细胞类别成分中，最over-represented terms为 nucleus (GO:0005634), plasma membrane (GO: 0005886) and mitochondrial inner membrane pre-sequence translocase complex (GO:0005744)。

4. 此外，进行了KEGG注释，以探索已鉴定的miRNA靶标的通路。

   其中，总共鉴定出214条通路目标，表明这些靶标的功能高度多样化。丰度最高的通路与胁迫有关的途径，包括：plant-pathogen interac�tion, plant hormone signal transduction, biosynthesis of secondary metabolites and MAPK signaling pathway 。

5. 此外，为了研究AB反应性miRNA和靶标之间的联系，使用Cytoscape进行网络分析。对于为那个罗的构建，包括了stress-responsive miRNAs and genes involved in AB stress response。

   这些应激反应基因包括：PR proteins, glycosyltransferases (GT), Pentatricopeptide repeat proteins (PPR) and disease resistance genes like NBS-LRR and Snakin。还包括几个TF，例如NAC, ERF and ARF。

Correlation analysis of miRNAs expression profiles and their target genes

此外，整合了AB反应性miRNA（来自小RNA-seq）和它们的靶基因（来自RNA-seq）的表达，以推断miRNA在AB感染过程中的介导作用。

1.使用Pearson相关系数对miRNA和其靶标miRNA表达谱进行相关分析，分别确定了在第3dpi和第7dpi胁迫条件下所有组合共有757和693miRNA-mRNA相互作用对。这些相关作用可以是连贯性的，也可以是不连贯性的。连贯性作用是当miRNA表达更小是mRNA表达较多时的相关作用。反之亦然。

相反，非连贯性在miRNA和mRNA的靶标中有相似的表达。

在757对中，在第3dpi时，有371对是non-coherent，而386对是coherent。

同样，在第7dpi时，693对中，357对是noncoherent，336是coherent。

我们进一步详细分析了coherent的相互作用。

在第3dpi时，由274个基因组成的386coherent pairs 发现了247个miRNA. 同样,在第7dpi时,鉴定出336个coherent pairs,包括262个基因和232个miRNA。与靶向它们的miRNA相比，更高数量的基因支持以下发现：单个miRNA具有切割多个靶标的能力。

2.从这些相关对中，我们可以鉴定出12对在抗性（包括BC3F6品系）和易感基因型之间均表现出mRNA和miRNA的相反表达。从这些对中，分别从3 dpi和7 dpi识别出五对和七对。

3.易看出，与易感基因型相比，在抗性基因型中有更多的miRNA被下调，其相应的靶标也被上调。

在所有抗药性基因型中，在第3 dpi时，miR159k-3p，miR482b-3p和miR156r等三个miRNA均被下调，其靶渗透压样蛋白，NBS-LRR和Squamosa启动子结合样蛋白分别被上调-规范的。

与这些已知的miRNA一起，还发现了靶向G型凝集素S受体（如丝氨酸苏氨酸激酶）的新型miRNA nov_miR66

相反，在所有抗性基因型中，miR3191均被上调，其靶标TCP转录因子被下调。在第7 dpi时，三个miRNA（包括miR171b，miR5232和miR157a）被上调，而它们的靶标，ERF基因，钙转运ATPase和与感觉相关的蛋白在抗性基因型中被下调。相反，四个miRNA，即miR162，miR167c，nov_miR101l和miR171被下调，而它们的靶标，Dicer样基因，Dof锌指，刀豆蛋白和PPR蛋白在抗性基因型中被上调。有趣的是，在这两个时间点，疾病抗性基因（例如NBS LRR（第3 dpi），渗透素（第3 dpi）和PPR（第7 dpi）蛋白）均被上调，而靶向它们的miRNA在耐药中被下调基因型与易感基因型相比。

4.在这12对miRNA-mRNA对中，也通过降解组测序验证了5对。这些对包括miR482b-3p：CC-NBS-LRR（Ca_08122），miR167c：Dof锌指蛋白（Ca_19433），miR171b：ERF（Ca_00359），miR157a：衰老相关蛋白（Ca_15107）和miR5232：钙转运ATPase（ Ca_12185）。

这12对中的4个基因位于先前报道的AB抗性QTL中。 Anbessa等人将Ca_02420与QTL在Ca8上共定位。 （2009），Tar’an等人在Ca3上的Ca_08122。 Sabbavarapu等人（2007），Ca6上的Ca_08506和Ca4上的Ca_04572。 （2013）

Validation of differential gene and miRNA expression

Discussion