临近新年了，今天29号，但是没啥年味呢？？今天我给大家分享一个单细胞空间联合分析的内容，文章在Single-Cell Transcriptomic Analyses of Tumor Ecosystems and Spatial Architectures in Human Small Cell Lung Cancer。
ABSTRACT
小细胞肺癌 (SCLC) 是一种高度异质性的疾病，其特征是侵袭性表型和预后不良。为了剖析 SCLC 生态系统中的细胞成分及其空间分布，对 12 个切除的人类原发性 SCLC 进行了单细胞 RNA 测序和空间转录组学分析。分析揭示了肿瘤和非肿瘤细胞的广泛异质性，以及主要的免疫抑制微环境。重要的是，多种杂合肿瘤细胞状态被揭露，包括杂合 SCLC 和肺腺癌细胞以及杂合肿瘤和免疫细胞，表明肿瘤细胞具有高表型可塑性。此外，揭示了这些杂合肿瘤细胞的细胞起源和进化，以及肿瘤-基质细胞串扰在驱动杂合细胞发育中的关键作用。总之，这项研究加深了对人类 SCLC 生态系统的理解，并为针对 SCLC 治疗的杂交肿瘤细胞和免疫抑制微环境提供了理论依据。
INTRODUCTION
小细胞肺癌 (SCLC) 是一种难治性肺癌，其特征是对化疗的初始反应后快速复发。不幸的是，在过去的三十年里，SCLC 患者的治疗选择非常有限。更糟糕的是，缺乏用于生物医学研究的手术标本一直是一个障碍，许多研究严重依赖临床前模型，例如基因工程小鼠和患者来源的异种移植 (PDX) 模型。然而，源自这些模型的肿瘤不能完全概括人类 SCLC 的生物学特征，例如浸润性免疫细胞和基质细胞以及肿瘤生态系统的空间结构。值得注意的是，SCLC 已被揭示为一种高度异质性的疾病，在小鼠和人类 SCLC 肿瘤中均表现出广泛的肿瘤间和肿瘤内异质性，这与侵袭性表型和预后不良直接相关。最近，基于转录因子（ASCL1、NEUROD1、POU2F3 和 YAP1）的差异表达定义了 SCLC 的四种分子亚型，包括 SCLC-A 和 SCLC-N 神经内分泌（NE）亚型，以及 SCLC-P 和 SCLC -Y 非 NE 亚型。不同的 SCLC 亚型对靶向治疗具有不同的脆弱性。例如，观察到 SCLC-A 亚型对 BCL2 抑制剂更敏感，而 SCLC-N 和 SCLC-P 亚型分别对极光激酶抑制剂和 PARP 抑制剂更敏感。最近，一种炎症亚型 (SCLC-I) 对免疫检查点阻断 (ICB) 表现出更高的敏感性。此外，MHC I 表达在具有非 NE 特征的 SCLC 细胞亚群中增加，已被确定为预测因子ICB 功效。鉴于 SCLC 肿瘤的异质性，迫切需要剖析肿瘤成分并提供更精细的 SCLC 亚型分类，以开发下一代精准疗法（有临床运用价值）。
近年来，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）已被广泛用于研究人类癌症中的肿瘤异质性，包括非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌，这提供了前所未有的研究。分辨率以表征肿瘤生态系统中不同细胞成分之间的单个细胞和细胞间通讯的分子特征。值得注意的是，scRNA-seq 还被用于使用 PDX、CDX 模型和人体标本研究 SCLC 的肿瘤异质性。例如，通过对 21 个人类 SCLC 标本进行 scRNA-seq 分析，发现了具有干细胞样特征的高 PLCG2 肿瘤细胞群。然而，在这些研究中测序的大多数 SCLC 标本都是活检样本，每个样本测序的单个细胞数量相对有限。此外，浸润的免疫细胞和基质细胞的landscope大多仍未探索。此外，尚未研究人类 SCLC 生态系统中不同细胞成分的空间结构。为了解决这些限制，本研究应用结合 scRNA-seq 和空间转录组学分析来剖析人类 SCLC 肿瘤中的细胞成分及其空间分布。研究结果揭示了组织和肿瘤内广泛的肿瘤异质性。分析还揭示了人类 SCLC 生态系统中主要的免疫抑制微环境。重要的是，发现了多种杂合肿瘤细胞状态，包括杂合肿瘤和免疫细胞的一个子集。通过整合 scRNA-seq 和空间转录组学分析，描述了不同cluster的分布及其在单个肿瘤中的相互作用。总之，分析工作提供了 SCLC 生态系统中细胞成分的单细胞图谱和空间分布。
RESULTS
A Single-Cell Transcriptome Atlas of Human Primary SCLC Tumors
为了剖析 SCLC 生态系统中的异质细胞成分及其空间分布，共收集了 12 名接受手术的 SCLC 患者的 12 个原发性肿瘤。首先，对 7 个 SCLC 进行了 scRNA-seq 分析，包括 3 个化疗治疗的肿瘤和 4 个未治疗的肿瘤。为了识别每个肿瘤中的稀有细胞亚群，对每个肿瘤平均约 13,800 个单细胞进行了测序，在所有肿瘤中总共有 81,841 个高质量细胞。通过无监督聚类分析，确定了 27 个不同的细胞clusters，包括肿瘤细胞、白细胞、基质成纤维细胞和内皮细胞。进一步推断每个clusters的拷贝数改变（CNV），以区分肿瘤和非肿瘤细胞。因此，基于推断的CNV和典型细胞类型标志物的表达，15个clusters被定义为肿瘤细胞，而9个clusters和3个clusters分别被分类为白细胞和基质细胞。值得注意的是，观察到大量肿瘤细胞同时表达 ASCL1 和 NEUROD1，表现出 SCLC-A 和 SCLC-N 亚型之间混合状态的特征。此外，在肿瘤微环境 (TME) 中鉴定出三种主要类型的基质细胞，包括 FAP+ ACTA2+ 肌成纤维细胞、MCAM+ ACTA2+ 血管周围样细胞和 PECAM1+ CD34+ 内皮细胞。此外，在 7 个 SCLC 中观察到广泛的肿瘤间和肿瘤内异质性。值得注意的是，发现 SCLC 生态系统中浸润的免疫细胞、基质成纤维细胞和内皮细胞的数量相对较低。此外，观察到与未治疗的肿瘤相比，化疗治疗的肿瘤中浸润的免疫细胞和基质细胞的比例相对较低，表明化疗可能会重塑 SCLC 微环境。
Spatial Transcriptomic Landscape of Cellular Components in SCLC Ecosystems
为了探索不同细胞成分的空间定位及其相互作用，接下来对 8 个经免疫组织化学验证的人类 SCLC 肿瘤进行了空间转录组学分析，包括 6 个 SCLC-A、1 个 SCLC-N 和 2 个 SCLC-P 肿瘤。 值得注意的是，8 个肿瘤中的 3 个（LC-250、LC-251 和 LC-51）通过 scRNA-seq 和空间转录组学进行了测序。 共捕获了来自 8 个肿瘤的 16,853 个spot，对其进行测序并分组为 17 个clusters。 接下来，探索了每个肿瘤内单个亚群的空间分布。 分析进一步揭示了 SCLC 广泛的肿瘤间和肿瘤内异质性。 因此，随后分别分析了单个肿瘤的空间转录组学数据。
例如，在 LC-251 中识别出 8 个空间spot clusters，包括 5 个肿瘤细胞clusters（clusters 1、4、5、7 和 8）和 3 个基质细胞clusters（clusters 2、3 和 6）。 我们观察到clusters 1、4 和 5 位于组织中心，而clusters 7 位于 LC-251 组织内的组织边缘。 通过query每个clsuters的差异基因表达，发现clusters 4 显示 H3F3A、HMGN2 和 TXN 的高表达，而clusters 7 显示 SFTPC 和 NAPSA 的高表达。 重要的是，观察到clusters 7 表达 SCLC 和肺腺癌 (LUAD) 的标志物，显示出混合转录状态的特征。 此外，发现clusters 5 表现出高表达的基质细胞标志物，如 COL4A1、SPARC、ESM1 和 RGS5。 同样，在 LC-51 组织中也发现了混合 SCLC/LUAD 细胞.
接下来，检查了 SCLC 组织内基质细胞和免疫细胞的空间分布。在 LC-251 组织中，观察到基质细胞（clusters 2 和 3）围绕并分离不同的肿瘤细胞clusters。 此外，CD45+免疫细胞往往在组织内分布稀疏，多为耗竭的CD8+ T细胞和M2巨噬细胞，表明存在免疫抑制微环境。 据我们所知，这是第一个使用高分辨率转录组学探索人类 SCLC 生态系统中细胞成分空间结构的分析。 结果不仅揭示了肿瘤内异质性的程度，而且还提供了 SCLC 肿瘤内不同细胞类型及其分子特征的空间分布.
Immune Cell Landscape and Spatial Distribution in SCLC Ecosystems
人类 SCLC 生态系统中浸润的白细胞和基质细胞的多样性和转录组学特征相对尚未探索。在这项研究中，通过 scRNA-seq 共鉴定出 14,755 个浸润性白细胞。观察到 7 个 SCLC 中免疫细胞的高肿瘤间和肿瘤内异质性。例如，LC-242 和 LC-254 肿瘤的免疫细胞浸润相对较高，而 LC-51 和 LC-255 肿瘤浸润较低。进一步将所有免疫细胞重新聚集成 23 个亚群。根据典型标记的表达，大多数亚群可定义为 CD4 T 细胞、CD8 T 细胞、NKT 细胞、浆细胞和 B 细胞、类胰蛋白酶 + 肥大细胞、浆细胞样树突状细胞 (pDC) 和单核细胞/巨噬细胞。然而，观察到 5 个亚群（clusters 7、11、12、13 和 22）也表达上皮细胞和神经内分泌细胞的标志物，例如 EPCAM、INSM1 和 ASCL1，显示出杂合肿瘤和免疫细胞的特征。值得注意的是，肿瘤细胞上免疫细胞标志物的阳性表达已在几种癌症中得到描述.
接下来，对 SCLC 生态系统中的 T 细胞亚群进行了表征。对于 CD4+ T 细胞，cluster 8 代表以高表达 FOXP3 为特征的调节性 T 细胞，cluster 9 代表显示高水平 CXCL13、NR3C1 和 FKBP5 的滤泡辅助 T 细胞，而cluster 3 指显示高水平 IL7R 和 BTG1 的细胞毒性 T 细胞.关于 CD8+ T 细胞，cluster 6、17 和 19 代表具有高表达 GZMK、CCL5、NKG7 和 GZMA 的细胞毒性 T 细胞，而cluster 10 表达高水平的 GNLY 和 KLRD1，代表 NKT 细胞。此外，发现cluster 16 包含 CD4+ 和 CD8+ T 细胞，并表现出 MKI67 和 ASPM 基因的高表达，代表增殖 T 细胞亚群。重要的是，发现大多数 T 细胞表现出与免疫检查点基因相关的阳性表达T 细胞耗竭，如 PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3 和 HAVCR2，表明免疫抑制微环境在 SCLC 微环境中占主导地位。
以前，已观察到 T 细胞和巨噬细胞是 SCLC 中最丰富的浸润免疫细胞，而通过免疫组织化学分析评估 B 细胞是稀疏的。 在这里，发现浸润的 B 细胞的比例与 SCLC 生态系统中的 T 细胞和骨髓细胞相当，但大多数 B 细胞是浆细胞并且表现出显著的异质性。 发现浆细胞的特征是 IGKC、IGHG1 和 MZB1 的高表达，而 CD20+ B 细胞的特征是 BANK1 和 CD37 的高表达。 此外，发现 CD20+ B 细胞群由活化的 (CD19+ CD20+ CD69+ CD27+) 和耗尽的 (CD19+ CD20+ CD69+ CD27-) 细胞组成。 通过差异表达基因的功能注释，观察到抗原加工和呈递是 CD20+ B 细胞中最丰富的途径之一。此外，观察到血浆和 CD20+ B 细胞在组织内分布稀疏 。
此外，确定了 4 个骨髓细胞亚群。 cluster 5 代表以 APOE、APOC1 和 SPP1 高表达为特征的 C1QB+ 巨噬细胞，而cluster 15 代表 FCN1+ 单核细胞，显示 S100A9、LYZ 和 CST3 的高表达。 此外，观察到cluster 23 代表高表达 TPSB2 和 TPSAB1 的肥大细胞亚群，而cluster 21 代表高表达 IRF7 和 GZMB 的 pDC。 此外，观察到大多数巨噬细胞表现出 CD163、LAIR1、HAVCR2、LGALS9、VSIR 和 LAG3 的高表达，表明免疫抑制性 M2 巨噬细胞在 SCLC TME 中占优势。最后，观察到巨噬细胞占优势并且主要分布在 LC 的基质内 -251 和 LC-29 肿瘤。 总之，分析提供了浸润免疫细胞的单细胞图谱及其在人类 SCLC 微环境中的空间分布。
Landscape of Stromal Fibroblasts and Endothelial Cells in SCLC Ecosystems
癌症相关成纤维细胞 (CAF) 是 TME 的主要组成部分，已被证明在肿瘤的发生和进展中起关键作用。然而，关于 CAF 的类别及其在 SCLC 中的功能作用知之甚少。在这里，通过 scRNA-seq 共鉴定出 3,145 个 CAF，将其分为 15 个亚群。此外，在 SCLC 生态系统中揭示了 5 个成纤维细胞状态（这个地方的方法还是要注意一下）。 S1 CAF 类似于血管周围样细胞，显示出 MCAM 和 ACTA2 的高表达，富含粘着斑、cGMP-PKG 信号传导和血管平滑肌收缩通路。 S2 CAF 代表以 FAP 和 PDGFRA 高表达为特征的肌成纤维细胞，富含 ECM-受体相互作用和粘着斑通路。重要的是，S3、S4 和 S5 成纤维细胞类似于经历 EMT 程序的肿瘤细胞，共表达间充质细胞和神经内分泌细胞的标志物，包括 ACTA2、INSM1、ASCL1 和 GRP。因此，可以将成纤维细胞分为三种主要亚型，包括 FAP+ 肌成纤维细胞、MCAM+ 血管周围样细胞和 EPCAM+ 成纤维细胞。已在多种癌症中发现抗原呈递和炎症性 CAF。有趣的是，发现一部分 EPCAM+ CAFs 也表达免疫细胞的标志物，例如第 3 clusters中 CD24、IGHG2 和 IGLC2 的高表达，以及第 13 clusters中 IGHG1、IGHG4 和 MZB1 的高表达。总的来说，研究提供了人类 SCLC 生态系统中 CAF 的单细胞图谱，并强调 EPCAM+ CAF 最有可能来自经历过 EMT program的肿瘤细胞。
此外，在 SCLC 生态系统中确定了总共 1,308 个血管内皮细胞 (ECs)，其中包含 10 个亚群，可分为 3 个状态。 S1 ECs 类似于肿瘤内皮细胞，共表达内皮细胞和神经内分泌细胞标志物，如 PECAM1、ASCL1 和 GRP。 S2 ECs表现出内皮细胞的典型特征，表达高水平的MCAM、ANGPT2和ESM1，而S3 ECs表现出高表达VWF、ACKR1、HLA-DRB5和RGS5。 值得注意的是，据报道，非神经内分泌 SCLC 细胞在转录上准备好进行血管模拟并表达假性缺氧的基因表达谱。 总的来说，这些发现表明，SCLC 细胞诱导血管生成以支持其快速生长的机制之一可能是通过肿瘤-内皮细胞转化。 最后，强调了基质细胞的异质性及其在人类 SCLC 组织中的空间定位。
Hybrid Tumor Cells with Multiple Cell Lineage Features Revealed in Human SCLCs
在这项研究中，通过 scRNA-seq 共鉴定出 62,633 个肿瘤细胞，占 7 个 SCLC ecosystems中所有细胞成分的约 77%。进一步将这些肿瘤细胞重新聚集成 26 个亚群，这些亚群在组织和肿瘤内表现出广泛的异质性。观察到大多数亚群同时表达 ASCL1 和 NEUROD1，显示出混合 SCLC-A/N 亚型的特征。还观察到一个 YAP1+ 细胞亚群（cluster 21 ）显示高表达 LUAD 标记，如 NAPSA、SFTPB 和 SCGB3A1。此外，观察到一些 POU2F3+ 肿瘤细胞，它们稀疏地分布在多个clusters中。值得注意的是，除了混合 SCLC-A/N 细胞外，还鉴定了多种其他混合肿瘤细胞状态，包括混合上皮/间充质 (E/M) 细胞、SCLC/LUAD 细胞和肿瘤/免疫细胞。例如，我们观察到clusters 21、16、11、17、25 和 8 中的细胞显示混合 E/M 特征，共表达上皮和间充质标志物。有趣的是，具有 EMT 特征的细胞子集也表达了 LUAD 标记，尤其是在 LC-51 样本中，这表明混合 SCLC/LUAD 细胞可能会经历 EMT 程序。此外，发现一些肿瘤细胞表现出高表达的免疫细胞标志物（CD45、CD27 和 HLA-DRA），表现出混合肿瘤/免疫特征。重要的是，通过流式细胞术分析证实了几种人类 SCLC 细胞系中存在表达免疫细胞标志物的肿瘤细胞。
最近，在具有非神经内分泌特征且与对免疫检查点阻断剂 (ICB) 的持久反应相关的一部分 SCLC 中观察到高 MHC I 表达，这表明 MHC I 可用作 SCLC 患者免疫反应的预测生物标志物。 在这里，观察到编码 MHC I 分子（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）的基因在几乎所有 SCLC 肿瘤细胞中的阳性表达。 有趣的是，发现编码 MHC II 分子（HLA-DRA 和 HLA-DRB1）的基因的表达也在 21、16、17、11、8 和 12 clusters中上调。MHC II 分子通常在professional抗原-呈递细胞，例如 DC、单核细胞和 B 细胞。 总的来说，这些发现表明大多数杂交肿瘤/免疫细胞也表现出 EMT 和/或杂交 SCLC/LUAD 细胞特征，并且可能对 ICB 治疗更敏感。 同样，还鉴定了表达内皮细胞标志物的肿瘤细胞亚群，例如 PECAM1、CDH5 和 CD34。
最后，空间转录组学分析表明，混合 SCLC/LUAD 细胞主要位于 LC-251 组织内的肿瘤边缘，而它们位于 LC-51 组织的中心。 LC-4肿瘤中的杂交SCLC-A/SCLC-P细胞和LC-29肿瘤中的杂交SCLC-P/SCLC-Y细胞在组织内随机分布。 总之，分析揭示了人类 SCLC 中的多个杂交肿瘤细胞。
Trajectory Analysis Reveals Cell of Origin of Hybrid SCLC Cells
为了追踪 SCLC ecosystems中肿瘤细胞的进化，对所有肿瘤细胞进行了轨迹分析。确定了 6 个分支和 9 个细胞states。观察到分支 1 由states 1、2、3 和 4 细胞组成，而分支 2、3、4、5 和 6 分别由states 9、8、7、5 和 6 细胞组成。值得注意的是，分支 5 和分支 6 中的细胞主要来源于 LC-255 肿瘤，表明存在更多分化states。观察到进化轨迹从states 1 细胞开始。随着时间的推移，其他 8 个states的细胞沿着轨迹进化。在 SCLC 细胞的进化过程中观察到了 4 个分支点，它们都可以成功分化成不同的分支。此外，分析了随伪时间变化的 SCLC 和 LUAD 的规范标记的表达。在轨迹开始时观察到 ASCL1、NEUROD1 和 INSM1 的最低表达（states 1），而这些基因的表达随着时间的推移逐步增加。相比之下，发现 LUAD 和间充质标志物（NAPSA、SFTPC、VIM）的表达随着伪时间逐步降低。一致地，观察到states 1 细胞显示混合 SCLC/LUAD 细胞的特征，而states 9 细胞代表混合 SCLC-A/SCLC-N 细胞，表明 LUAD 和 SCLC 之间存在潜在的细胞谱系转变。总之，研究结果表明，一种潜在的杂交肿瘤细胞起源细胞，例如杂交 SCLC/LUAD 细胞，可能源自 LUAD 细胞谱系。
SCLC-P 亚型约占所有 SCLC 的 15%，被认为是一种具有更强侵袭性的非神经内分泌型。据报道，一些 SCLC-P 肿瘤可能起源于肺上皮中的稀有簇状细胞，并表达簇状细胞的典型标志物，如 POU2F3、ASCL2 和 AVIL。然而，这种亚型的细胞起源尚未得到很好的定义。在本研究中，鉴定了多种混合 SCLC-P 细胞，例如 LC-4 肿瘤中的混合 SCLC-A/SCLC-P 细胞和 LC-29 肿瘤中的混合 SCLC-P/SCLC-Y 细胞。为了揭示 SCLC-P 亚型的新起源细胞，研究了这些肿瘤中肿瘤细胞的进化。轨迹分析揭示了 LC-29 肿瘤中的 3 个分支和 3 个细胞状态。轨迹根从state 1 细胞开始，该细胞由来自cluster 6 的细胞组成，其特征是 LUAD 标记的高表达，例如 NAPSA、SFTPC。随着时间的推移，肿瘤细胞分化为 2 个分支，其中分支 2 富含来自cluster 2 和 7 的细胞，而分支 3 富含来自cluster 1、2、3、4、5 和 8 的细胞。值得注意的是，观察到LUAD标志物的表达减少，而POU2F3、YAP1、ASCL2和MYC的表达在分支1到分支3的转变过程中增加。此外，发现LC-29肿瘤表达相对较高水平的KRT5、KRT8和NKX2-1基因.总之，这些发现表明 SCLC-P 亚型可能起源于肺上皮细胞中的多种细胞类型，例如角蛋白 + 基底细胞、肺泡细胞和 LUAD 细胞的转化。根据这一假设，最近在转化的 SCLC 的研究中揭示了 SCLC-P 的簇细胞非依赖性起源。
此外，我们在 LC-4 肿瘤中鉴定了 4 个分支和 5 个细胞状态。 基于每个clusters的组织学特征和基因表达特征，我们将cluster 3 定义为相邻的正常肺细胞，将cluster 2 和 5 定义为基质细胞，将cluster 1、4、6 和 7 定义为肿瘤细胞。 因此，观察到轨迹根起源于状态 1 细胞，其中填充了来自cluster 1 和 7 的肿瘤细胞，并且以非神经内分泌标志物（包括 ASCL2 和 POU2F3）的高表达为特征。 随着时间的推移，肿瘤细胞可以分化为states 4 和 5，它们由来自cluster 4 和 6 的细胞组成，并显示出神经内分泌标志物的高表达。 因此，可以看到 LC-4 肿瘤内从 SCLC-P 到 SCLC-A 亚型的转变，从cluster 1 开始，到cluster 4 和 6 结束。这些发现表明，SCLC-P 细胞可能分化为 混合 SCLC-A/SCLC-P 细胞。
Exploration of Cellular Crosstalk in SCLC Ecosystems
最后，为了确定驱动肿瘤异质性的分子机制，特别是杂交肿瘤细胞的发展，分析了 7 个 SCLC 生态系统中所有 27 个细胞成分之间的配体-受体相互作用。 因此，共鉴定了 34,546 对配体-受体相互作用。 值得注意的是，观察到肿瘤和免疫细胞之间的大量相互作用。 骨髓细胞表现出最大数量的相互作用对。 骨髓和肿瘤细胞之间的大多数相互作用是由与免疫反应和细胞外基质相关的分子介导的，例如 CD74-MIF/COPA/APP、HLA-DPB1-TNFSF13B/NRG1 和 SPP1-CD44 对，以及由趋化因子介导 及其受体，例如 CCL3-IDE、CCL2-CCR10 和 CXCL8-ACKR1 对。 此外，观察到 T 细胞和肿瘤细胞之间的几种已知抑制性相互作用，例如 TIGIT-NECTIN2/NECTIN3 和 PDCD1-CD274/PDCD1LG2 对。据报道，CAFs 可以分泌多种趋化因子和生长因子，从而能够重塑 TME 并调节肿瘤进展。 在这里，观察到 CAF 和肿瘤细胞之间的广泛相互作用，其中大部分是由趋化因子和免疫相关分子介导的，例如 TIMP1-FGFR2 和 HLA-C-FAM3C 对。 同样，揭示了内皮细胞和肿瘤细胞之间的相互作用，包括 CD74-MIF 和 NRP1-VEGFB 对。
重要的是，确定了杂交肿瘤细胞和基质细胞之间的多种相互作用。例如，发现杂交 SCLC/LUAD 细胞（cluster 7 ）和骨髓细胞之间的相互作用是由 CD74-MIF/COPA、C5AR1-RPS19 和 SPP1-CD44 对介导的，而杂交肿瘤/免疫细胞之间的相互作用（cluster 9 ）和 FAP+CAFs（cluster 14）由趋化因子、Notch 配体及其各自的受体介导，表明基质细胞可能通过增强细胞间通讯来驱动这些杂交肿瘤细胞的发育。最后，还展示了组织内不同细胞类型之间的细胞间通讯。例如，探索了基质细胞（cluster 2、3 和 6 ）与肿瘤细胞之间的相互作用，尤其是 LC-251 肿瘤内的混合 SCLC/LUAD 肿瘤细胞（cluster 7）。观察到CD74在基质细胞中的表达相对较高，而COPA、APP和MIF的表达水平在肿瘤细胞中相对较高。总之，工作代表了剖析 SCLC 生态系统中细胞成分之间的细胞间通讯的第一步，并提供了在 SCLC 进展过程中由配体-受体相互作用介导的细胞串扰网络。
DISCUSSION
了解驱动肿瘤异质性和进展的细胞和分子机制对于开发新的治疗策略至关重要。单细胞 RNA-seq 已被用于分析 SCLC 的肿瘤异质性。然而，这些研究并未提供人类原发性 SCLC 微环境中所有细胞成分及其空间结构的综合单细胞图谱。特别是免疫和基质细胞的景观尚未得到彻底研究。在这里，迈出了第一步，通过使用 scRNA-seq 和空间转录组学技术剖析人类 SCLC 的复杂生态系统。 SCLC的特点是免疫细胞浸润低的免疫性冷肿瘤。因此，研究还揭示了 SCLC 生态系统中免疫细胞的低浸润。然而，数据揭示了肿瘤和组织内浸润的免疫细胞的多样性和异质性，以及它们的转录特征。重要的是，工作表明，由耗尽的 T 细胞和 M2 巨噬细胞介导的免疫抑制微环境在 SCLC 生态系统中占主导地位。此外，探索了 SCLC 组织内不同免疫亚群的空间分布，并表明大多数免疫细胞稀疏地定位于 SCLC 组织内。
此外，研究揭示了人类 SCLC 生态系统中基质成纤维细胞的广泛异质性，因为确定了 15 个 CAF 亚群。值得注意的是，鉴定了一部分 EPCAM+ 成纤维细胞，它们可能是接受了 EMT 程序的肿瘤细胞。最近，CD105 已被用作定义基质成纤维细胞的标志物，CD105 成纤维细胞能够促进胰腺癌的抗肿瘤免疫。在目前的研究中，发现 MCAM 可以区分 SCLC 中的成纤维细胞。 MCAM+ 成纤维细胞表现出 RGS5、COX4I2 和 FAM162B 的高表达，而 MCAM-CAF 表现出细胞外基质成分（如 FAP、PDGFRA 和 PDPN）的高表达。据报道，FAP+ CAF 与多种癌症中的免疫抑制微环境有关。此外，CAF 中的 PDPN 表达与肺腺癌疾病复发风险增加有关。因此，我们的研究结果表明，这些 MCAM 成纤维细胞可能有助于 SCLC 的免疫抑制微环境。
最近，在对 38 个 SCLC CDX 模型的分析中发现了一种新的 ATOH1+ SCLC 亚型。还鉴定了具有干细胞样特征的新型 PLCG2+ SCLC 细胞亚群，并与耗尽的 CD8+ T 细胞和免疫抑制性骨髓细胞群相关。有趣的是，本研究揭示了多个混合 SCLC 细胞亚群。肿瘤细胞的混合或中间状态已在癌症中广泛报道，例如混合 E/M 细胞。此外，杂交内皮/间充质和杂交肿瘤/内皮细胞也已在癌症中发现。最近，通过单细胞测序在几种癌症中发现了杂交肿瘤细胞。 SCLC 的表型可塑性已被认为是 SCLC 细胞变得更具攻击性的一种机制。例如，在人类 SCLC 中揭示了 SCLC-A 和 SCLC-N 之间的中间状态。此外，通过批量和 scRNA-seq 数据的原型分析揭示了 SCLC 亚型之间的连续塑性细胞状态。此外，在少数肺部肿瘤中发现了联合 SCLC 和 NSCLC。例如，从 NSCLC 向 SCLC 的转化已成为驱动免疫检查点抑制剂耐药的机制之一。根据这些观察结果，我们还剖析了 SCLC 细胞的表型可塑性，例如在异源 SCLC 生态系统中存在多个杂交 SCLC 细胞，指的是具有多种细胞谱系特征的肿瘤细胞。
例如，发现了几种新型杂交细胞，包括杂交 SCLC/LUAD 和杂交肿瘤/免疫细胞。最近，已经在鼻咽癌、皮肤鳞状细胞癌和头颈部鳞状细胞癌等多种癌症中发现了表达免疫特征的肿瘤细胞。例如，在鼻咽癌中发现了表达肿瘤和免疫细胞双重标志物（EPCAM、MHC-II 和补体基因）的肿瘤细胞亚群，并观察到其具有增加的致瘤特性并与不良预后相关。此外，据报道，肿瘤细胞与白细胞的融合有助于肿瘤异质性和增加的转移行为。然而，据我们所知，显示出免疫特征的 SCLC 细胞尚未在其生态系统中被描述。观察到几个肿瘤细胞亚群共表达免疫细胞（CD45 和 CD27）和神经内分泌细胞（INSM1 和 ASCL1）的标志物。因此，假设这些混合肿瘤/免疫细胞更可能是具有免疫细胞特征的肿瘤细胞。然而，这些杂交细胞的生物学作用需要在未来的研究中确定。
我们的研究提供了几个新发现。首先，这是人类初级 SCLC 生态系统中细胞成分及其空间分布的第一个单细胞转录组景观。其次，本研究提供了人类 SCLC 生态系统中不同浸润性免疫细胞、基质成纤维细胞和内皮细胞的全面视图和分子特征。第三，我们确定了 SCLC 细胞的多种杂交状态，从杂交 SCLC 亚型、杂交 SCLC/LUAD 到杂交肿瘤/免疫细胞，表明 SCLC 细胞的动态进化发生在 SCLC 生态系统中。第四，还揭示了这些杂合 SCLC 细胞的进化以及 SCLC-P 亚型的新潜在细胞来源。最后，这项研究全面了解了人类 SCLC 生态系统中细胞成分内部和细胞之间的细胞间通讯，为针对这些相互作用进行 SCLC 治疗提供了理论依据。鉴于 SCLC 的异质性，未来的研究将需要整合更多的 SCLC 样本并结合更高分辨率的空间转录组学技术。确定我们已经确定的肿瘤细胞状态的各种混合状态的功能作用和临床相关性也至关重要。总之，本研究提供了人类 SCLC 生态系统中细胞成分及其空间分布的综合单细胞图谱，揭示了组织和肿瘤内肿瘤、免疫和基质细胞的广泛异质性，并深入了解了它们的转录状态。研究还揭示了人类 SCLC 中的多种杂交肿瘤细胞状态，表明靶向这些杂交肿瘤细胞可以为 SCLC 患者的下一代治疗策略奠定基础。
Methods（关注一些重点方法）
Cell-cell interaction analysis
Copy-number variation analysis
生活很好，有你更好