定量分析htseq

HTSeq使用注意事项

简述:

  1. HTSeq是转录组定量分析的软件,其输入文件必须有bam(sorted)和GTF文件。
  2. 一般情况下HTSeq得到的Counts结果会用于下一步不同样品间的基因表达量差异分析,而不是一个样品内部基因的表达量比较。因此,HTSeq设置了-a参数的默认值10,来忽略掉比对到多个位置的reads信息,其结果有利于后续的差异分析。
  3. 输入的GTF文件中不能包含可变剪接信息,否则HTSeq会认为每个可变剪接都是单独的基因,导致能比对到多个可变剪接转录本上的reads的计算结果是ambiguous,从而不能计算到基因的count中。即使设置-i参数的值为transcript_id,其结果一样是不准确的,只是得到transcripts的表达量。
  • htseq-count -f bam -r name -s no -a 10 -t exon -i gene_id -m sorted.bam genome.gtf > counts.txt

参数

-f | --format default: sam 设置输入文件的格式,该参数的值可以是sam或bam。

-r | --order default: name 设置sam或bam文件的排序方式,该参数的值可以是name或pos。前者表示按read名进行排序,后者表示按比对的参考基因组位置进行排序。若测序数据是双末端测序,当输入sam/bam文件是按pos方式排序的时候,两端reads的比对结果在sam/bam文件中一般不是紧邻的两行,程序会将reads对的第一个比对结果放入内存,直到读取到另一端read的比对结果。因此,选择pos可能会导致程序使用较多的内存,它也适合于未排序的sam/bam文件。而pos排序则表示程序认为双末端测序的reads比对结果在紧邻的两行上,也适合于单端测序的比对结果。很多其它表达量分析软件要求输入的sam/bam文件是按pos排序的,但HTSeq推荐使用name排序,且一般比对软件的默认输出结果也是按name进行排序的。

-s | --stranded default: yes 设置是否是链特异性测序。该参数的值可以是yes,no或reverse。no表示非链特异性测序;若是单端测序,yes表示read比对到了基因的正义链上;若是双末端测序,yes表示read1比对到了基因正义链上,read2比对到基因负义链上;reverse表示双末端测序情况下与yes值相反的结果。根据说明文件的理解,一般情况下双末端链特异性测序,该参数的值应该选择reverse。

-a | --a default: 10 忽略比对质量低于此值的比对结果。在0.5.4版本以前该参数默认值是0。
-t | --type default: exon 程序会对该指定的feature(gtf/gff文件第三列)进行表达量计算,而gtf/gff文件中其它的feature都会被忽略。
-i | --idattr default: gene_id 设置feature ID是由gtf/gff文件第9列那个标签决定的;若gtf/gff文件多行具有相同的feature ID,则它们来自同一个feature,程序会计算这些features的表达量之和赋给相应的feature ID。
-m | --mode default: union 设置表达量计算模式。该参数的值可以有union, intersection-strict and intersection-nonempty。这三种模式的选择请见上面对这3种模式的示意图。从图中可知,对于原核生物,推荐使用intersection-strict模式;对于真核生物,推荐使用union模式。
-o | --samout 输出一个sam文件,该sam文件的比对结果中多了一个XF标签,表示该read比对到了某个feature上。
-q | --quiet 不输出程序运行的状态信息和警告信息。

分析脚本

cufflinks --no-update-check \
          -o Sample_tmp\
          -u  --max-bundle-frags 2000000 \
          -p 6 \
          --library-type fr-firststrand  \
          -b genome/genome.fa -G genome/gene.gtf sorted.bam
          
usage: htseq-count [options] alignment_file gff_file


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