麒麟991
麒麟991

完整的单细胞分析通用流程——质控

质控

scRNA-seq数据中的低质量文库可能有多种来源，例如解离过程中的细胞损伤或文库制备失败（例如无效的逆转录或PCR扩增）。这些通常表现为总计数低，表达的基因很少，线粒体或spike-in比例高的“细胞”。这些低质量的库是有问题的，因为它们可能导致下游分析中的误导性结果：

1.它们形成了自己独特的细胞群，使对结果的解释变得复杂。最明显的原因是细胞损伤后线粒体比例增加或核RNA富集。在最坏的情况下，由不同细胞类型产生的低质量文库可以基于损伤诱导表达谱中的相似性聚集在一起，从而在其他不同亚群之间形成人为的中间状态或轨迹。此外，由于转换后平均值的变化，非常小的库可以形成自己的集群。
2.他们在方差估计或主成分分析过程中扭曲了集群异质性的特征。前几个主要成分将捕获质量差异而不是生物学差异，从而降低降维效果。同样，差异最大的基因将由低质量细胞与高质量细胞之间的差异驱动。最明显的例子：计数非常低的低质量文库，其中归一化放大了那些库中恰好具有非零计数的基因的表观变异。
3.它们包含的基因似乎由于主动缩放以针对小文库进行标准化而被强烈“上调”。这对于污染的以低但恒定水平存在于所有文库中的转录本（例如，来自环境溶液）最成问题。在低质量文库中增加的缩放比例会以较大的标准化表达值将这些转录物的计数转换为少量，从而导致与其他细胞相比明显的上调。这可能会产生误导，因为受影响的基因通常具有生物学敏感性，但实际上在另一个亚群中表达。
为了避免（或至少减轻）这些问题，我们需要在分析开始时删除这些细胞。此步骤通常称为细胞层面的质量控制（QC）。 （这里我们将互换使用“库”和“细胞”，尽管在处理基于液滴的数据时他们的区别将变得很重要。）我们将演示使用A. T. L. Lun等人的小型scRNA-seq数据集。 该版本没有事先进行质量控制，因此我们可以应用。

#--- loading ---#
library(scRNAseq)
sce.416b <- LunSpikeInData(which="416b") 
sce.416b$block <- factor(sce.416b$block)

sce.416b

## class: SingleCellExperiment 
## dim: 46604 192 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(46604): ENSMUSG00000102693 ENSMUSG00000064842 ...
##   ENSMUSG00000095742 CBFB-MYH11-mcherry
## rowData names(1): Length
## colnames(192): SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1
##   SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1 ...
##   SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1
##   SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1
## colData names(9): Source Name cell line ... spike-in addition block
## reducedDimNames(0):
## altExpNames(2): ERCC SIRV

质控指标的选择

我们使用几种常见的QC指标，根据表达谱来鉴定低质量的细胞。这些指标将在下面针对SMART-seq2数据的reads进行质控，但相同的过程适用于由其他技术（如MARS-seq和基于液滴的方法）生成的UMI数据。

1.库大小定义为每个细胞的所有相关feature的总计数之和。在这里，我们将相关feature视为内源基因。具有小文库的细胞质量低下，因为在文库制备过程中某个时刻由于细胞裂解或无效的cDNA捕获和扩增导致RNA丢失。
2.每个细胞中表达feature的数量定义为该细胞计数为非零的内源基因的数量。由于尚未成功捕获多样化的转录物种群，任何具有很少表达基因的细胞都可能质量较差。
3.计算“映射到spike-in转录本的reads数量”相对于“每个细胞所有feature（包括spike-in）reads的总数”的比例。由于应该向每个细胞中添加相同量的spike-in RNA，因此spike-in计数的任何富集都是内源RNA丢失的征兆。因此，高比例表明劣质细胞，可能由于部分细胞裂解或解离过程中的RNA降解而丢失了内源RNA。

  1. 在没有spike-in转录物的情况下，可以使用定位到线粒体基因组中基因的reads的比例。高比例表明细胞质量较差，可能是由于穿孔细胞的细胞质RNA丢失。理由是，在存在适度损害的情况下，细胞膜上的孔允许单个转录物分子外排，但过小而无法使线粒体逸出，从而导致线粒体转录物相对富集。对于单核RNA-seq实验，高比例也很有用，因为它们可以标记尚未成功剥离细胞质的细胞。
    对于每个细胞，我们使用来自scater包的perCellQCMetrics（）函数来计算这些QC指标。 sum列包含每个细胞的总数，detected列包含检测到的基因数。 subsets_Mito_percent列包含映射到线粒体转录本的reads的百分比。 （出于演示目的，我们展示了两种确定每个转录本的基因组位置的方法。）最后，altexps_ERCC_percent列包含映射到ERCC转录本的reads的百分比。
# Retrieving the mitochondrial transcripts using genomic locations included in
# the row-level annotation for the SingleCellExperiment.
location <- rowRanges(sce.416b)
is.mito <- any(seqnames(location)=="MT")

# ALTERNATIVELY: using resources in AnnotationHub to retrieve chromosomal
# locations given the Ensembl IDs; this should yield the same result.
library(AnnotationHub)
ens.mm.v97 <- AnnotationHub()[["AH73905"]]
chr.loc <- mapIds(ens.mm.v97, keys=rownames(sce.416b),
    keytype="GENEID", column="SEQNAME")
is.mito.alt <- which(chr.loc=="MT")

library(scater)
df <- perCellQCMetrics(sce.416b, subsets=list(Mito=is.mito))
df

## DataFrame with 192 rows and 12 columns
##                                             sum  detected subsets_Mito_sum
##                                                
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1     865936      7618            78790
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1    1076277      7521            98613
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1    1180138      8306           100341
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1    1342593      8143           104882
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1    1668311      7154           129559
## ...                                         ...       ...              ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1    776622      8174            48126
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1   1299950      8956           112225
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1   1800696      9530           135693
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1     46731      6649             3505
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1   1866692     10964           150375
##                                       subsets_Mito_detected
##                                                   
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1                     20
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1                     20
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1                     19
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1                     20
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1                     22
## ...                                                     ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    20
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    25
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    23
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    16
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    29
##                                       subsets_Mito_percent altexps_ERCC_sum
##                                                          
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1               9.09882            65278
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1               9.16242            74748
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1               8.50248            60878
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1               7.81190            60073
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1               7.76588           136810
## ...                                                    ...              ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1              6.19684            61575
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1              8.63302            94982
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1              7.53559           113707
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1              7.50037             7580
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1              8.05569            48664
##                                       altexps_ERCC_detected
##                                                   
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1                     39
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1                     40
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1                     42
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1                     42
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1                     44
## ...                                                     ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    39
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    41
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    40
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    44
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1                    39
##                                       altexps_ERCC_percent altexps_SIRV_sum
##                                                          
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1               6.80658            27828
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1               6.28030            39173
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1               4.78949            30058
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1               4.18567            32542
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1               7.28887            71850
## ...                                                    ...              ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1              7.17620            19848
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1              6.65764            31729
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1              5.81467            41116
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1             13.48898             1883
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1              2.51930            16289
##                                       altexps_SIRV_detected
##                                                   
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1                      7
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1                      7
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1                      7
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1                      7
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1                      7
## ...                                                     ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1                     7
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1                     7
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1                     7
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1                     7
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1                     7
##                                       altexps_SIRV_percent     total
##                                                   
## SLX-9555.N701_S502.C89V9ANXX.s_1.r_1               2.90165    959042
## SLX-9555.N701_S503.C89V9ANXX.s_1.r_1               3.29130   1190198
## SLX-9555.N701_S504.C89V9ANXX.s_1.r_1               2.36477   1271074
## SLX-9555.N701_S505.C89V9ANXX.s_1.r_1               2.26741   1435208
## SLX-9555.N701_S506.C89V9ANXX.s_1.r_1               3.82798   1876971
## ...                                                    ...       ...
## SLX-11312.N712_S505.H5H5YBBXX.s_8.r_1             2.313165    858045
## SLX-11312.N712_S506.H5H5YBBXX.s_8.r_1             2.224004   1426661
## SLX-11312.N712_S507.H5H5YBBXX.s_8.r_1             2.102562   1955519
## SLX-11312.N712_S508.H5H5YBBXX.s_8.r_1             3.350892     56194
## SLX-11312.N712_S517.H5H5YBBXX.s_8.r_1             0.843271   1931645

或者，有的人可能更喜欢使用addPerCellQC（）函数。 这将计算每个细胞的QC统计信息并将其附加到SingleCellExperiment对象的colData中，从而使我们能够将所有相关信息保留在单个对象中，以供以后处理。

sce.416b <- addPerCellQC(sce.416b, subsets=list(Mito=is.mito))
colnames(colData(sce.416b))

##  [1] "Source Name"              "cell line"               
##  [3] "cell type"                "single cell well quality"
##  [5] "genotype"                 "phenotype"               
##  [7] "strain"                   "spike-in addition"       
##  [9] "block"                    "sum"                     
## [11] "detected"                 "subsets_Mito_sum"        
## [13] "subsets_Mito_detected"    "subsets_Mito_percent"    
## [15] "altexps_ERCC_sum"         "altexps_ERCC_detected"   
## [17] "altexps_ERCC_percent"     "altexps_SIRV_sum"        
## [19] "altexps_SIRV_detected"    "altexps_SIRV_percent"    
## [21] "total"

此处的关键假设是QC指标与每个细胞的生物学状态无关。 差异（例如，低文库大小，高线粒体比例）被认为是由技术因素而不是生物学过程驱动的，这意味着随后去除的细胞不会在下游分析中歪曲生物学过程。 严重违反此假设可能会导致细胞类型丢失，例如该实验体系本身具有较低的RNA含量或大量的线粒体。 我们可以使用其他诊断工具来检查此类现象（后续高级分析中讲解）。

鉴定低质量细胞

识别低质量单元的最简单方法是在QC指标上应用阈值。 例如，如果库大小小于100,000reads，我们可能会认为这些单元的质量较低； 表达少于5,000个基因； spike-in率超过10％; 或线粒体比例超过10％。

c.lib <- df$sum < 1e5
qc.nexprs <- df$detected < 5e3
qc.spike <- df$altexps_ERCC_percent > 10
qc.mito <- df$subsets_Mito_percent > 10
discard <- qc.lib | qc.nexprs | qc.spike | qc.mito

# Summarize the number of cells removed for each reason.
DataFrame(LibSize=sum(qc.lib), NExprs=sum(qc.nexprs),
    SpikeProp=sum(qc.spike), MitoProp=sum(qc.mito), Total=sum(discard))

## DataFrame with 1 row and 5 columns
##     LibSize    NExprs SpikeProp  MitoProp     Total
##       
## 1         3         0        19        14        33

虽然简单，但此策略需要大量经验才能确定每种实验方案和生物系统的合适阈值。 基于reads计数的数据的阈值根本不适用于基于UMI的数据，反之亦然。 线粒体活性或总RNA含量的差异要求分别针对不同的生物系统不断调整线粒体阈值和spike-in阈值。 确实，即使使用相同的方法和系统，由于cDNA捕获效率和每细胞测序深度的差异，适当的阈值也可能因运行而异。

自适应阈值

识别异常值

为了获得合适的阈值，我们假设大多数数据集由高质量细胞组成。然后，我们根据所有细胞中每个指标的中位数的中位数绝对偏差（MAD），确定对于各种QC指标而言异常的细胞。具体来说，如果某个值在“问题”方向上距离中位数多于3个MAD，则认为该值是异常值。这种过滤器将保留遵循正态分布的99％的非异常值。

对于416B数据，我们确定对数转换的库大小比中位数低3个MAD的细胞。对数转换用type =“ lower”时以较小的值提高分辨率。具体而言，它保证阈值不是负值，这对于非负矩阵而言将毫无意义。此外，文库大小的分布表现出较重的右尾并不罕见。对数转换可避免MAD膨胀，从而可能损害左尾的异常检测。 （更一般而言，它证明上述99％的理由是合理的。）

qc.lib2 <- isOutlier(df$sum, log=TRUE, type="lower")

我们对经对数转化的表达基因进行相同的操作

qc.nexprs2 <- isOutlier(df$detected, log=TRUE, type="lower")

isOutlier() 还会在输出向量的属性中返回每个指标的确切过滤阈值。 这些对于检查自动选择的阈值是否合适非常有用。

attr(qc.lib2, "thresholds")

##  lower higher 
## 434083    Inf

attr(qc.nexprs2, "thresholds")

##  lower higher 
##   5231    Inf

我们为具有相同功能的基于比例的指标识别异常值。 这些分布经常显示出较重的右尾，但是与前两个指标不同，正是右尾本身包含了假定的低质量细胞。 因此，我们不执行任何变换来缩小尾巴-而是希望将尾巴中的细胞识别为较大的离群值。 （虽然理论上有可能获得高于100％的毫无意义的阈值，但这很少见，因此不会引起实际关注。）

qc.spike2 <- isOutlier(df$altexps_ERCC_percent, type="higher")
attr(qc.spike2, "thresholds")

##  lower higher 
##   -Inf  14.15

qc.mito2 <- isOutlier(df$subsets_Mito_percent, type="higher")
attr(qc.mito2, "thresholds")

##  lower higher 
##   -Inf  11.92

对于这些指标中的任何一个异常的细胞都被认为质量低下并被丢弃。

discard2 <- qc.lib2 | qc.nexprs2 | qc.spike2 | qc.mito2

# Summarize the number of cells removed for each reason.
DataFrame(LibSize=sum(qc.lib2), NExprs=sum(qc.nexprs2),
    SpikeProp=sum(qc.spike2), MitoProp=sum(qc.mito2), Total=sum(discard2))

## DataFrame with 1 row and 5 columns
##     LibSize    NExprs SpikeProp  MitoProp     Total
##       
## 1         4         0         1         2         6

或者，可以使用quickPerCellQC（）函数将整个过程一步完成。

reasons <- quickPerCellQC(df, 
    sub.fields=c("subsets_Mito_percent", "altexps_ERCC_percent"))
colSums(as.matrix(reasons))

##              low_lib_size            low_n_features high_subsets_Mito_percent 
##                         4                         0                         2 
## high_altexps_ERCC_percent                   discard 
##                         1                         6

使用此策略，阈值可适应给定指标的值分布的位置和分布。 这使得QC程序可以适应测序深度，cDNA捕获效率，线粒体含量等方面的变化，而无需任何用户干预或事先经验。 但是，它确实需要一些假设，下面将对其进行详细讨论。

离群值检测的假设

离群检测假定大多数细胞具有可接受的质量。这通常是合理的，并且在某些情况下可以通过肉眼检查细胞是否完整（例如在微孔板上）进行实验支持。如果大多数的细胞质量（不可接受）低，则自适应阈值显然会失败，因为它们无法删除大多数细胞。当然，在旁观者眼中，可接受的与否是随情境改变的——例如，众所周知，神经元很难分解，而我们通常会在某个QC指标下将细胞保留在神经元scRNA-seq数据集的，而在更严格的条件下如胚胎干细胞这个QC指标是不可接受的。

前面提到的另一个假设是，质控指标与每个细胞的生物学状态无关。这在高度异质性细胞群体中最有可能被违反，其中某些细胞类型天然具有更少的总RNA或更多的线粒体。即使没有捕获或测序方面的任何技术问题，也可能将此类细胞视为异常值并删除。通过考虑QC指标中的生物变异性，MAD的使用在某种程度上减轻了该问题。异类种群在高质量细胞之间的指标应具有较高的可变性，从而增加了MAD并减少了错误删除特定细胞类型的机会（以降低去除低质量细胞的能力为代价）。

通常，这些假设是合理的，或者它们的违反对下游结论影响很小。尽管如此，在解释结果时记住它们还是有帮助的。

考虑实验因素

更复杂的研究可能涉及使用不同实验参数（例如测序深度）生成的细胞批次。在这种情况下，自适应策略应分别应用于每个批次。从包含多个批次样品的混合物分布中计算中位数和MAD几乎没有意义。例如，如果一个批次中的测序覆盖率比其他批次低，则它将拖低中位数并使MAD膨胀。这将降低自适应阈值对其他批次的适用性。

如果每个批次都由其自己的SingleCellExperiment表示，则isOutlier（）函数可以直接应用于每个批次，如上所示。但是，如果所有批次中的细胞已合并到单个SingleCellExperiment中，则应该使用batch =参数来确保在每个批次中都识别出异常值。这允许isOutlier（）适应批次之间质量控制指标的系统差异。

我们将再次使用416B数据集进行说明，该数据集包含两个实验因素-原始和癌基因诱导状态。我们将这些因素结合在一起，并通过quickPerCellQC（）在isOutlier（）的batch =参数中使用它。这将导致去除更多的细胞，因为（i）批次之间测序深度的系统差异和（ii）致癌基因诱导表达的基因数量差异不再使MAD膨胀。

batch <- paste0(sce.416b$phenotype, "-", sce.416b$block)
batch.reasons <- quickPerCellQC(df, batch=batch,
    sub.fields=c("subsets_Mito_percent", "altexps_ERCC_percent"))
colSums(as.matrix(batch.reasons))

##              low_lib_size            low_n_features high_subsets_Mito_percent 
##                         5                         4                         2 
## high_altexps_ERCC_percent                   discard 
##                         6                         9

也就是说，batch =的使用包含一个更强的假设，即每个批次中的大多数单元都是高质量的。 如果整个批次失败，则异常检测将无法充当该批次的适当QC筛选器。 例如，Grun等人中有两个批次。人类胰腺数据集包含相当一部分推定的受损细胞，其ERCC含量高于其他批次（图1）。 这会使这些批次中的中位数和MAD膨胀，导致无法删除假定的低质量细胞。 在这种情况下，最好从其他批次中计算出一个共享的中位数和MAD，并使用这些估计值来为有问题的批次中的细胞获取适当的过滤阈值，如下所示。

library(scRNAseq)
sce.grun <- GrunPancreasData()
sce.grun <- addPerCellQC(sce.grun)

# First attempt with batch-specific thresholds.
discard.ercc <- isOutlier(sce.grun$altexps_ERCC_percent,
    type="higher", batch=sce.grun$donor)
with.blocking <- plotColData(sce.grun, x="donor", y="altexps_ERCC_percent",
    colour_by=I(discard.ercc))

# Second attempt, sharing information across batches
# to avoid dramatically different thresholds for unusual batches.
discard.ercc2 <- isOutlier(sce.grun$altexps_ERCC_percent,
    type="higher", batch=sce.grun$donor,
    subset=sce.grun$donor %in% c("D17", "D2", "D7"))
without.blocking <- plotColData(sce.grun, x="donor", y="altexps_ERCC_percent",
    colour_by=I(discard.ercc2))

gridExtra::grid.arrange(with.blocking, without.blocking, ncol=2)
图1：在Grun胰腺数据集的每个供体中ERCC转录物比例的分布。 每个点代表一个细胞，并根据是在每个批次中将其识别为异常值（左）还是使用公共阈值（右）来着色

为了确定有问题的批次，一个有用的经验法则是找到质量控制阈值与其他批次的阈值相比异常的批次。 这里的假设是，大多数批次由大多数高质量细胞组成，因此阈值应遵循“典型”批次中的某些单峰分布。 如果我们观察到一个批处理具有极高的阈值，我们可能会怀疑它包含大量会使每个批处理的MAD膨胀的低质量细胞。 我们在下面以Grun等人数据演示此过程。

ercc.thresholds <- attr(discard.ercc, "thresholds")["higher",]
ercc.thresholds

##     D10     D17      D2      D3      D7 
##  73.611   7.600   6.011 113.106  15.217

names(ercc.thresholds)[isOutlier(ercc.thresholds, type="higher")]

## [1] "D10" "D3"

如果我们不能假设大多数批次都包含大多数高质量细胞，那么所有猜测都将消失； 我们必须恢复选择任意阈值并希望达到最佳效果的方法。

其他方法

另一种策略是基于每个细胞的QC指标来识别高维空间中的异常值。 我们使用来自robustbase的方法基于它们的QC指标来量化每个细胞的“异常”，然后使用isOutlier（）来识别表现出异常高水平异常的低质量细胞。

stats <- cbind(log10(df$sum), log10(df$detected),
    df$subsets_Mito_percent, df$altexps_ERCC_percent)

library(robustbase)
outlying <- adjOutlyingness(stats, only.outlyingness = TRUE)
multi.outlier <- isOutlier(outlying, type = "higher")
summary(multi.outlier)

##    Mode   FALSE    TRUE 
## logical     179      13

这种方法和相关方法（例如基于PCA的异常检测和支持向量机）可以提供更高的能力，以区分低质量的细胞与高质量的细胞，因为它们可以利用许多QC指标中的模式。 但是，这需要付出一些可解释性的代价，因为删除给定细胞的原因可能并不总是很明显。

为了完整起见，我们注意到也可以从基因表达谱而非质量控制指标中识别异常值。 我们认为这是一种冒险的策略，因为它可以去除稀有细胞群中的高质量细胞。

检查诊断图

检查QC指标的分布是个好习惯（图2），可以发现可能的问题。 在最理想的情况下，我们将看到正态分布可以证明离群值检测中使用的3 MAD阈值是合理的。 其他模型的细胞表明QC指标可能与某种生物学状态相关，有可能导致过滤过程中不同细胞类型的损失。 或细胞亚群的文库制备存在不一致，这在基于plate的实验方案中很常见。 然后，可以快速识别出任何指标的系统差值批次，以进行进一步的故障排除或彻底删除，就像上面的图1一样。

colData(sce.416b) <- cbind(colData(sce.416b), df)
sce.416b$block <- factor(sce.416b$block)
sce.416b$phenotype <- ifelse(grepl("induced", sce.416b$phenotype),
    "induced", "wild type")
sce.416b$discard <- reasons$discard

gridExtra::grid.arrange(
    plotColData(sce.416b, x="block", y="sum", colour_by="discard",
        other_fields="phenotype") + facet_wrap(~phenotype) + 
        scale_y_log10() + ggtitle("Total count"),
    plotColData(sce.416b, x="block", y="detected", colour_by="discard", 
        other_fields="phenotype") + facet_wrap(~phenotype) + 
        scale_y_log10() + ggtitle("Detected features"),
    plotColData(sce.416b, x="block", y="subsets_Mito_percent", 
        colour_by="discard", other_fields="phenotype") + 
        facet_wrap(~phenotype) + ggtitle("Mito percent"),
    plotColData(sce.416b, x="block", y="altexps_ERCC_percent", 
        colour_by="discard", other_fields="phenotype") + 
        facet_wrap(~phenotype) + ggtitle("ERCC percent"),
    ncol=1
)
图2：416B数据集中每个批次和表型的质量控制指标分布。 每个点代表一个细胞，并根据是否被丢弃分别着色。

另一个有用的诊断方法是针对其他一些QC指标绘制线粒体计数比例。 目的是要确认没有总计数和线粒体计数都很高的细胞，以确保我们不会无意中去除代谢活跃的高质量细胞（例如肝细胞）。 我们证明了使用来自涉及老鼠大脑的更大实验的数据； 在这种情况下，我们在图3的右上角没有观察到任何可能与新陈代谢活跃且未受损的细胞相对应的点。

#--- loading ---#
library(scRNAseq)
sce.zeisel <- ZeiselBrainData()

library(scater)
sce.zeisel <- aggregateAcrossFeatures(sce.zeisel, 
    id=sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(sce.zeisel)))

#--- gene-annotation ---#
library(org.Mm.eg.db)
rowData(sce.zeisel)$Ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, 
    keys=rownames(sce.zeisel), keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")

sce.zeisel <- addPerCellQC(sce.zeisel, 
    subsets=list(Mt=rowData(sce.zeisel)$featureType=="mito"))

qc <- quickPerCellQC(colData(sce.zeisel), 
    sub.fields=c("altexps_ERCC_percent", "subsets_Mt_percent"))
sce.zeisel$discard <- qc$discard

plotColData(sce.zeisel, x="sum", y="subsets_Mt_percent", colour_by="discard")
图3：在Zeisel脑数据集中分配给线粒体转录本的UMI的百分比，相对于UMI的总数进行绘制（顶部）。 每个点都代表一个细胞，并根据是否被视为劣质并被丢弃对其进行着色。

我们看到所有这些指标相互之间显示出较弱的相关性，大概是细胞损伤的共同潜在作用的体现。 相关性的弱点促使人们使用多种指标来捕获技术质量的不同方面。 当然，不利的一面是，这些指标还可能代表生物学的不同方面，增加了丢弃整个细胞类型的风险。

移除劣质细胞

识别出低质量的细胞后，我们可以选择删除它们或对其进行标记。 删除是最简单的选项，可以通过按列设置SingleCellExperiment来实现。

＃保留我们不想丢弃的列。
filtered <- sce.416b[,!reasons$discard]

质量控制期间最大的实际问题是是否会无意中丢弃整个细胞群。 由于QC指标永远不会完全独立于生物学状态，因此始终存在发生这种情况的风险。 我们可以通过寻找丢弃细胞和保留细胞之间基因表达的系统差异来判断细胞类型是否有丢失。 为了证明这一点，我们计算了416B数据集中废弃池和保留池的平均计数，并计算了池平均值之间的对数倍变化。

# Using the 'discard' vector for demonstration purposes, 
# as it has more cells for stable calculation of 'lost'.
lost <- calculateAverage(counts(sce.416b)[,!discard])
kept <- calculateAverage(counts(sce.416b)[,discard])

library(edgeR)
logged <- cpm(cbind(lost, kept), log=TRUE, prior.count=2)
logFC <- logged[,1] - logged[,2]
abundance <- rowMeans(logged)

如果丢弃的池中富集了某种细胞类型，则应观察到相应标记基因的表达增加。 在图4中，丢弃池中没有明显的基因上调系统，这表明QC步骤并未无意间过滤掉416B数据集中的细胞类型。

plot(abundance, logFC, xlab="Average count", ylab="Log-FC (lost/kept)", pch=16)
points(abundance[is.mito], logFC[is.mito], col="dodgerblue", pch=16)
图4：与416B数据集中的保留细胞相比，丢弃的细胞中表达的对数倍变化。 每个点代表一个带有蓝色线粒体转录本的基因。

为了进行比较，让我们考虑来自10X Genomics的PBMC数据集的QC步骤。 我们将对库大小应用任意固定的阈值来过滤细胞，而不是使用任何基于异常值的方法。 具体来说，我们会删除所有库大小小于500的库。

#--- loading ---#
library(DropletTestFiles)
raw.path <- getTestFile("tenx-2.1.0-pbmc4k/1.0.0/raw.tar.gz")
out.path <- file.path(tempdir(), "pbmc4k")
untar(raw.path, exdir=out.path)

library(DropletUtils)
fname <- file.path(out.path, "raw_gene_bc_matrices/GRCh38")
sce.pbmc <- read10xCounts(fname, col.names=TRUE)

#--- gene-annotation ---#
library(scater)
rownames(sce.pbmc) <- uniquifyFeatureNames(
    rowData(sce.pbmc)$ID, rowData(sce.pbmc)$Symbol)

library(EnsDb.Hsapiens.v86)
location <- mapIds(EnsDb.Hsapiens.v86, keys=rowData(sce.pbmc)$ID, 
    column="SEQNAME", keytype="GENEID")

#--- cell-detection ---#
set.seed(100)
e.out <- emptyDrops(counts(sce.pbmc))
sce.pbmc <- sce.pbmc[,which(e.out$FDR <= 0.001)]

discard <- colSums(counts(sce.pbmc)) < 500
lost <- calculateAverage(counts(sce.pbmc)[,discard])
kept <- calculateAverage(counts(sce.pbmc)[,!discard])

logged <- edgeR::cpm(cbind(lost, kept), log=TRUE, prior.count=2)
logFC <- logged[,1] - logged[,2]
abundance <- rowMeans(logged)

在图5中，废弃池中存在一个独特的种群，这是一组在丢失中强烈上调的基因。 这包括PF4，PPBP和SDPR，它们（（扰流板警报！）表示存在被alt.discard丢弃的血小板群。

plot(abundance, logFC, xlab="Average count", ylab="Log-FC (lost/kept)", pch=16)
platelet <- c("PF4", "PPBP", "SDPR")
points(abundance[platelet], logFC[platelet], col="orange", pch=16)

图5

如果我们怀疑细胞类型已被我们的质量控制程序错误地丢弃，则最直接的解决方案是放宽质量控制过滤器，以获取与真正的生物学差异相关的指标。例如，可以通过在isOutlier（）调用中增加nmads =来放宽异常检测。当然，这增加了保留更多低质量细胞的风险。
顺便说一句，值得一提的是，细胞的真正技术质量也可能与其类型相关。 （这与细胞类型和QC指标之间的相关性不同，因为后者是我们对质量的不完美代理。）如果某些细胞类型在scRNA-seq协议期间不适合解离或微流体处理，则可能出现这种情况。在这种情况下，如果QC的所有细胞都损坏，则可以“正确”丢弃整个细胞类型。确实，与实验方案中的损失相比，对QC期间细胞类型的计算去除的关注可能很小。

6.6标记劣质细胞

另一种选择是照这样标记低质量的细胞，并将其保留在下游分析中。 此处的目的是允许形成低质量细胞的群，然后在解释结果时识别并忽略这些群。 这种方法避免了丢弃质量控制指标值较差的细胞类型，从而为用户提供了机会来决定此类细胞的群是否代表真正的生物学状态。

marked <- sce.416b
marked$discard <- batch.reasons$discard

缺点是它将QC的负担转移到了细胞群的解释上，这已经是scRNA-seq数据分析的瓶颈。确实，如果我们不相信QC指标，我们将不得不仅基于标记基因来区分真正的细胞类型和低质量的细胞，由于后者倾向于“表达”有趣的基因，因此这并不总是那么容易。保留低质量细胞也会损害方差建模的准确性，例如，需要使用更多的PC来抵消早期PC受低质量细胞和其他细胞之间的差异驱动的事实。

对于常规分析，我们建议默认执行清除操作，以避免低质量细胞引起的并发问题。这样一来，大多数群结构的特征都无需担心或至少不会担心其有效性。完成初始分析后，如果对丢弃的细胞类型有任何疑问，可以在仅标记低质量细胞的情况下进行更彻底的重新分析。这样可以恢复具有低RNA含量，高线粒体比例等的细胞类型，仅在初始分析中“填补空白”的情况下才需要对其进行解释。

你可能感兴趣的:(完整的单细胞分析通用流程——质控)

  • 斤斤计较的婚姻到底有多难？ 白心之岂必有为
    很多人私聊我会问到在哪个人群当中斤斤计较的人最多？我都会回答他，一般婚姻出现问题的斤斤计较的人士会非常多，以我多年经验，在婚姻落的一塌糊涂的人当中，斤斤计较的人数占比在20～30%以上，也就是说10个婚姻出现问题的斤斤计较的人有2-3个有多不减。在婚姻出问题当中，有大量的心理不平衡的、尖酸刻薄的怨妇。在婚姻中仅斤斤计较有两种类型：第一种是物质上的，另一种是精神上的。在物质与精神上抠门已经严重的影响
  • 情绪觉察日记第37天 露露_e800
    今天是家庭关系规划师的第二阶最后一天，慧萍老师帮我做了个案，帮我处理了埋在心底好多年的一份恐惧，并给了我深深的力量！这几天出来学习，爸妈过来婆家帮我带小孩，妈妈出于爱帮我收拾东西，并跟我先生和婆婆产生矛盾，妈妈觉得他们没有照顾好我…。今晚回家见到妈妈，我很欣赏她并赞扬她，妈妈说今晚要跟我睡我说好，当我们俩躺在床上准备睡觉的时候，我握着妈妈的手对她说:妈妈这几天辛苦你了，你看你多利害把我们的家收拾得
  • 芦花鞋一四 许叶晗
    又是在一个寒冷的夏日里，青铜和葵花决定今天一起去卖芦花鞋，奶奶亲手给他们做了一碗热乎乎的粥对他们说:“就靠你们两挣生活费了这碗粥赶紧趁热喝了吧！”于是青铜和葵花喝完了奶奶给她们做的粥，就准备去镇上卖卢花鞋，这回青铜和葵花穿着新的芦花鞋来到了镇上。青铜这回看到了很多人都在卖，用手势表达对葵花说:“这回有好多人在抢我们生意呢！我们必须得吆喝起来。”葵花点了点头。可是谁知他们也大声的叫，卖芦花喽！卖芦花
  • QQ群采集助手，精准引流必备神器 2401_87347160 其他经验分享
    功能概述微信群查找与筛选工具是一款专为微信用户设计的辅助工具，它通过关键词搜索功能，帮助用户快速找到相关的微信群，并提供筛选是否需要验证的群组的功能。主要功能关键词搜索：用户可以输入关键词，工具将自动查找包含该关键词的微信群。筛选功能：工具提供筛选机制，用户可以选择是否只显示需要验证或不需要验证的群组。精准引流：通过上述功能，用户可以更精准地找到目标群组，进行有效的引流操作。3.设备需求该工具可以
  • 关于沟通这件事，项目经理不需要每次都面对面进行 流程大师兄
    很多项目经理都会遇到这样的问题，项目中由于事情太多，根本没有足够的时间去召开会议，那在这种情况下如何去有效地管理项目中的利益相关者？当然，不建议电子邮件也不需要开会的话，建议可以采取下面几种方式来形成有效的沟通，这几种方式可以帮助你努力的通过各种办法来保持和各方面的联系。项目经理首先要问自己几个问题，项目中哪些利益相关者是必须要进行沟通的？可以列出项目中所有的利益相关者清单，同时也整理出项目中哪些
  • 机器学习与深度学习间关系与区别 ℒℴѵℯ心·动ꦿ໊ོ꫞ 人工智能学习深度学习python
    一、机器学习概述定义机器学习（MachineLearning,ML）是一种通过数据驱动的方法，利用统计学和计算算法来训练模型，使计算机能够从数据中学习并自动进行预测或决策。机器学习通过分析大量数据样本，识别其中的模式和规律，从而对新的数据进行判断。其核心在于通过训练过程，让模型不断优化和提升其预测准确性。主要类型1.监督学习（SupervisedLearning）监督学习是指在训练数据集中包含输入
  • 铭刻于星（四十二） 随风至
    69夜晚，绍敏同学做完功课后，看了眼房外，没听到动静才敢从书包的夹层里拿出那个心形纸团。折痕压得很深，都有些旧了，想来是已经写好很久了。绍敏同学慢慢地、轻轻地捏开折叠处，待到全部拆开后，又反复抚平纸张，然后仔细地一字字默看。只是开头的三个字是第一次看到，让她心漏跳了几拍。“亲爱的绍敏：从四年级的时候，我就喜欢你了，但是我一直不敢说，怕影响你学习。六年级的时候听说有人跟你表白，你接受了，我很难过，但
  • 底层逆袭到底有多难，不甘平凡的你准备好了吗？让吴起给你说说 造命者说
    底层逆袭到底有多难，不甘平凡的你准备好了吗？让吴起给你说说我叫吴起，生于公元前440年的战国初期，正是群雄并起、天下纷争不断的时候。后人说我是军事家、政治家、改革家，是兵家代表人物。评价我一生历仕鲁、魏、楚三国，通晓兵家、法家、儒家三家思想，在内政军事上都有极高的成就。周安王二十一年（公元前381年），因变法得罪守旧贵族，被人乱箭射死。我出生在卫国一个“家累万金”的富有家庭，从年轻时候起就不甘平凡
  • 2020-01-25 晴岚85
    郑海燕坚持分享590天2020.1.24在生活中只存在两个问题。一个问题是：你知道想要达成的目标是什么，但却不知道如何才能达成；另一个问题是：你不知道你的目标是什么。前一个是行动的问题，后一个是结果的问题。通过制定具体的下一步行动，可以解决不知道如何开始行动的问题。而通过去想象结果，对结果做预估，可以解决找不着目标的问题。对于所有吸引我们注意力，想要完成的任务，你可以先想象一下，预期的结果究竟是什
  • 随笔 | 仙一般的灵气 海思沧海
    仙岛今天，我看了你全部，似乎已经进入你的世界我不知道，这是否是梦幻，还是你仙一般的灵气吸引了我也许每一个人都要有一份属于自己的追求，这样才能够符合人生的梦想，生活才能够充满着阳光与快乐我不知道，我为什么会这样的感叹，是在感叹自己的人生，还是感叹自己一直没有孜孜不倦的追求只感觉虚度了光阴，每天活在自己的梦中，活在一个不真实的世界是在逃避自己，还是在逃避周围的一切有时候我嘲笑自己，嘲笑自己如此的虚无，
  • 想家 爆米花机
    也许不同于大家对家乡的思念，我对家乡甚至是疯狂的不舍。还未踏出车站就感觉到幸福，我享受这里的夕阳、这里的浓烈柴火味、这里每一口家常菜。我是宅女，我贪恋家的安逸。刚刚踏出大学校门，初出茅庐，无法适应每年只能国庆和春节回家。我焦虑、失眠、无端发脾气，是无法适应工作的节奏，是无法接受我将一步步离开家乡的事实。我不想承认自己胸无大志，选择再次踏上征程。图片发自App
  • 【iOS】MVC设计模式 Magnetic_h iosmvc设计模式objective-c学习ui
    MVC前言如何设计一个程序的结构，这是一门专门的学问，叫做"架构模式"（architecturalpattern），属于编程的方法论。MVC模式就是架构模式的一种。它是Apple官方推荐的App开发架构，也是一般开发者最先遇到、最经典的架构。MVC各层controller层Controller/ViewController/VC（控制器）负责协调Model和View，处理大部分逻辑它将数据从Mod
  • OC语言多界面传值五大方式 Magnetic_h iosui学习objective-c开发语言
    前言在完成暑假仿写项目时，遇到了许多需要用到多界面传值的地方，这篇博客来总结一下比较常用的五种多界面传值的方式。属性传值属性传值一般用前一个界面向后一个界面传值，简单地说就是通过访问后一个视图控制器的属性来为它赋值，通过这个属性来做到从前一个界面向后一个界面传值。首先在后一个界面中定义属性@interfaceBViewController:UIViewController@propertyNSSt
  • 一百九十四章. 自相矛盾 巨木擎天
    唉！就这么一夜，林子感觉就像过了很多天似的，先是回了阳间家里，遇到了那么多不可思议的事情儿。特别是小伙伴们，第二次与自己见面时，僵硬的表情和恐怖的气氛，让自己如坐针毡，打从心眼里难受！还有东子，他现在还好吗？有没有被人欺负？护城河里的小鱼小虾们，还都在吗？水不会真的干枯了吧？那对相亲相爱漂亮的太平鸟儿，还好吧！春天了，到了做窝、下蛋、喂养小鸟宝宝的时候了，希望它们都能够平安啊！虽然没有看见家人，也
  • UI学习——cell的复用和自定义cell Magnetic_h ui学习
    目录cell的复用手动（非注册）自动（注册）自定义cellcell的复用在iOS开发中，单元格复用是一种提高表格（UITableView）和集合视图（UICollectionView）滚动性能的技术。当一个UITableViewCell或UICollectionViewCell首次需要显示时，如果没有可复用的单元格，则视图会创建一个新的单元格。一旦这个单元格滚动出屏幕，它就不会被销毁。相反，它被添
  • element实现动态路由+面包屑 软件技术NINI vue案例vue.js前端
    el-breadcrumb是ElementUI组件库中的一个面包屑导航组件，它用于显示当前页面的路径，帮助用户快速理解和导航到应用的各个部分。在Vue.js项目中，如果你已经安装了ElementUI，就可以很方便地使用el-breadcrumb组件。以下是一个基本的使用示例：安装ElementUI（如果你还没有安装的话）:你可以通过npm或yarn来安装ElementUI。bash复制代码npmi
  • 10月|愿你的青春不负梦想-读书笔记-01 Tracy的小书斋
    本书的作者是俞敏洪，大家都很熟悉他了吧。俞敏洪老师是我行业的领头羊吧，也是我事业上的偶像。本日摘录他书中第一章中的金句：『一个人如果什么目标都没有，就会浑浑噩噩，感觉生命中缺少能量。能给我们能量的，是对未来的期待。第一件事，我始终为了进步而努力。与其追寻全世界的骏马，不如种植丰美的草原，到时骏马自然会来。第二件事，我始终有阶段性的目标。什么东西能给我能量？答案是对未来的期待。』读到这里的时候，我便
  • C语言宏函数 南林yan C语言c语言
    一、什么是宏函数？通过宏定义的函数是宏函数。如下，编译器在预处理阶段会将Add(x,y)替换为((x)*(y))#defineAdd(x,y)((x)*(y))#defineAdd(x,y)((x)*(y))intmain(){inta=10;intb=20;intd=10;intc=Add(a+d,b)*2;cout<
  • 地推话术，如何应对地推过程中家长的拒绝 校师学
    相信校长们在做地推的时候经常遇到这种情况：市场专员反馈家长不接单，咨询师反馈难以邀约这些家长上门，校区地推疲软，招生难。为什么？仅从地推层面分析，一方面因为家长受到的信息轰炸越来越多，对信息越来越“免疫”；而另一方面地推人员的专业能力和营销话术没有提高，无法应对家长的拒绝，对有意向的家长也不知如何跟进，眼睁睁看着家长走远；对于家长的疑问，更不知道如何有技巧地回答，机会白白流失。由于回答没技巧和专业
  • 谢谢你们，爱你们！ 鹿游儿
    昨天家人去泡温泉，二个孩子也带着去，出发前一晚，匆匆下班，赶回家和孩子一起收拾。饭后，我拿出笔和本子（上次去澳门时做手帐的本子）写下了1\2\3\4\5\6\7\8\9,让后让小壹去思考，带什么出发去旅游呢？她在对应的数字旁边画上了，泳衣、泳圈、肖恩、内衣内裤、tapuy、拖鞋……画完后，就让她自己对着这个本子，将要带的，一一带上，没想到这次带的书还是这本《便便工厂》(晚上姑婆发照片过来，妹妹累得
  • C语言如何定义宏函数？ 小九格物 c语言
    在C语言中，宏函数是通过预处理器定义的，它在编译之前替换代码中的宏调用。宏函数可以模拟函数的行为，但它们不是真正的函数，因为它们在编译时不会进行类型检查，也不会分配存储空间。宏函数的定义通常使用#define指令，后面跟着宏的名称和参数列表，以及宏展开后的代码。宏函数的定义方式：1.基本宏函数：这是最简单的宏函数形式，它直接定义一个表达式。#defineSQUARE(x)((x)*(x))2.带参
  • 微服务下功能权限与数据权限的设计与实现 nbsaas-boot 微服务java架构
    在微服务架构下，系统的功能权限和数据权限控制显得尤为重要。随着系统规模的扩大和微服务数量的增加，如何保证不同用户和服务之间的访问权限准确、细粒度地控制，成为设计安全策略的关键。本文将讨论如何在微服务体系中设计和实现功能权限与数据权限控制。1.功能权限与数据权限的定义功能权限：指用户或系统角色对特定功能的访问权限。通常是某个用户角色能否执行某个操作，比如查看订单、创建订单、修改用户资料等。数据权限：
  • 理解Gunicorn：Python WSGI服务器的基石 范范0825 ipythonlinux运维
    理解Gunicorn：PythonWSGI服务器的基石介绍Gunicorn，全称GreenUnicorn，是一个为PythonWSGI（WebServerGatewayInterface）应用设计的高效、轻量级HTTP服务器。作为PythonWeb应用部署的常用工具，Gunicorn以其高性能和易用性著称。本文将介绍Gunicorn的基本概念、安装和配置，帮助初学者快速上手。1.什么是Gunico
  • 小丽成长记（四十三） 玲玲54321
    小丽发现，即使她好不容易调整好自己的心态下一秒总会有不确定的伤脑筋的事出现，一个接一个的问题，人生就没有停下的时候，小问题不断出现。不过她今天看的书，她接受了人生就是不确定的，厉害的人就是不断创造确定性，在Ta的领域比别人多的确定性就能让自己脱颖而出，显示价值从而获得的比别人多的利益。正是这样的原因，因为从前修炼自己太少，使得她现在在人生道路上打怪起来困难重重，她似乎永远摆脱不了那种无力感，有种习
  • 学点心理知识，呵护孩子健康 静候花开_7090
    昨天听了华中师范大学教育管理学系副教授张玲老师的《哪里才是学生心理健康的最后庇护所，超越教育与技术的思考》的讲座。今天又重新学习了一遍，收获匪浅。张玲博士也注意到了当今社会上的孩子由于心理问题导致的自残、自杀及伤害他人等恶性事件。她向我们普及了一个重要的命题，她说心理健康的一些基本命题，我们与我们通常的一些教育命题是不同的，她还举了几个例子，让我们明白我们原来以为的健康并非心理学上的健康。比如如果
  • 2021年12月19日，春蕾教育集团团建活动感受——黄晓丹 黄错错加油
    感受:1.从陌生到熟悉的过程。游戏环节让我们在轻松的氛围中得到了锻炼，也增长了不少知识。2.游戏过程中，我们贡献的是个人力量，展现的是团队的力量。它磨合的往往不止是工作的熟悉，更是观念上契合度的贴近。3.这和工作是一样的道理。在各自的岗位上，每个人摆正自己的位置、各司其职充分发挥才能，并团结一致劲往一处使，才能实现最大的成功。新知:1.团队精神需要不断地创新。过去，人们把创新看作是冒风险，现在人们
  • Cell Insight | 单细胞测序技术又一新发现，可用于HIV-1和Mtb共感染个体诊断 尐尐呅
    结核病是艾滋病合并其他疾病中导致患者死亡的主要原因。其中结核病由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）感染引起，获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）由人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV-1）感染引起。国家感染性疾病临床医学研究中心/深圳市第三人民医院张国良团队携手深圳华大生命科学研究院吴靓团队，共同研究得出单细胞测序
  • c++ 的iostream 和 c++的stdio的区别和联系 黄卷青灯77 c++算法开发语言iostreamstdio
    在C++中，iostream和C语言的stdio.h都是用于处理输入输出的库，但它们在设计、用法和功能上有许多不同。以下是两者的区别和联系：区别1.编程风格iostream（C++风格）：C++标准库中的输入输出流类库，支持面向对象的输入输出操作。典型用法是cin（输入）和cout（输出），使用>操作符来处理数据。更加类型安全，支持用户自定义类型的输入输出。#includeintmain(){in
  • 瑶池防线 谜影梦蝶
    冥华虽然逃过了影梦的军队，但他是一个忠臣，他选择上报战况。败给影梦后成逃兵，高层亡尔还活着，七重天失守......随便一条，即可处死冥华。冥华自然是知道以仙界高层的习性此信一发自己必死无疑，但他还选择上报实情，因为责任。同样此信送到仙宫后，知道此事的人，大多数人都认定冥华要完了，所以上到仙界高层，下到扫大街的，包括冥华自己，全都准备好迎接冥华之死。如果仙界现在还属于两方之争的话，冥华必死无疑。然而
  • 爬山后遗症 璃绛
    爬山，攀登，一步一步走向制高点，是一种挑战。成功抵达是一种无法言语的快乐，在山顶吹吹风，看看风景，这是从未有过的体验。然而，爬山一时爽，下山腿打颤，颠簸的路，一路向下走，腿部力量不够，走起来抖到不行，停不下来了！第二天必定腿疼，浑身酸痛，坐立难安！
  • Hadoop(一) 朱辉辉33 hadooplinux
    今天在诺基亚第一天开始培训大数据，因为之前没接触过Linux，所以这次一起学了，任务量还是蛮大的。 首先下载安装了Xshell软件，然后公司给了账号密码连接上了河南郑州那边的服务器，接下来开始按照给的资料学习，全英文的，头也不讲解，说锻炼我们的学习能力，然后就开始跌跌撞撞的自学。这里写部分已经运行成功的代码吧.    在hdfs下，运行hadoop fs -mkdir /u
  • maven An error occurred while filtering resources blackproof maven报错
    转：http://stackoverflow.com/questions/18145774/eclipse-an-error-occurred-while-filtering-resources   maven报错： maven An error occurred while filtering resources   Maven -> Update Proje
  • jdk常用故障排查命令 daysinsun jvm
    linux下常见定位命令： 1、jps      输出Java进程       -q       只输出进程ID的名称，省略主类的名称；       -m      输出进程启动时传递给main函数的参数；     &nb
  • java 位移运算与乘法运算 周凡杨 java位移运算乘法
      对于 JAVA 编程中，适当的采用位移运算，会减少代码的运行时间，提高项目的运行效率。这个可以从一道面试题说起：     问题： 用最有效率的方法算出2 乘以8 等於几?” 答案：2 << 3 由此就引发了我的思考，为什么位移运算会比乘法运算更快呢？其实简单的想想，计算机的内存是用由 0 和 1 组成的二
  • java中的枚举(enmu) g21121 java
    从jdk1.5开始，java增加了enum(枚举)这个类型，但是大家在平时运用中还是比较少用到枚举的，而且很多人和我一样对枚举一知半解，下面就跟大家一起学习下enmu枚举。先看一个最简单的枚举类型，一个返回类型的枚举： public enum ResultType { /** * 成功 */ SUCCESS, /** * 失败 */ FAIL,
  • MQ初级学习 510888780 activemq
    1.下载ActiveMQ 去官方网站下载：http://activemq.apache.org/ 2.运行ActiveMQ 解压缩apache-activemq-5.9.0-bin.zip到C盘，然后双击apache-activemq-5.9.0-\bin\activemq-admin.bat运行ActiveMQ程序。 启动ActiveMQ以后，登陆：http://localhos
  • Spring_Transactional_Propagation 布衣凌宇 springtransactional
    //事务传播属性 @Transactional(propagation=Propagation.REQUIRED)//如果有事务，那么加入事务，没有的话新创建一个 @Transactional(propagation=Propagation.NOT_SUPPORTED)//这个方法不开启事务 @Transactional(propagation=Propagation.REQUIREDS_N
  • 我的spring学习笔记12-idref与ref的区别 aijuans spring
    idref用来将容器内其他bean的id传给<constructor-arg>/<property>元素，同时提供错误验证功能。例如： <bean id ="theTargetBean" class="..." /> <bean id ="theClientBean" class=&quo
  • Jqplot之折线图 antlove jsjqueryWebtimeseriesjqplot
    timeseriesChart.html <script type="text/javascript" src="jslib/jquery.min.js"></script> <script type="text/javascript" src="jslib/excanvas.min.js&
  • JDBC中事务处理应用 百合不是茶 javaJDBC编程事务控制语句
      解释事务的概念; 事务控制是sql语句中的核心之一;事务控制的作用就是保证数据的正常执行与异常之后可以恢复   事务常用命令:             Commit提交         
  • [转]ConcurrentHashMap Collections.synchronizedMap和Hashtable讨论 bijian1013 java多线程线程安全HashMap
    在Java类库中出现的第一个关联的集合类是Hashtable，它是JDK1.0的一部分。 Hashtable提供了一种易于使用的、线程安全的、关联的map功能，这当然也是方便的。然而，线程安全性是凭代价换来的――Hashtable的所有方法都是同步的。此时，无竞争的同步会导致可观的性能代价。Hashtable的后继者HashMap是作为JDK1.2中的集合框架的一部分出现的，它通过提供一个不同步的
  • ng-if与ng-show、ng-hide指令的区别和注意事项 bijian1013 JavaScriptAngularJS
            angularJS中的ng-show、ng-hide、ng-if指令都可以用来控制dom元素的显示或隐藏。ng-show和ng-hide根据所给表达式的值来显示或隐藏HTML元素。当赋值给ng-show指令的值为false时元素会被隐藏，值为true时元素会显示。ng-hide功能类似，使用方式相反。元素的显示或
  • 【持久化框架MyBatis3七】MyBatis3定义typeHandler bit1129 TypeHandler
    什么是typeHandler? typeHandler用于将某个类型的数据映射到表的某一列上，以完成MyBatis列跟某个属性的映射   内置typeHandler MyBatis内置了很多typeHandler，这写typeHandler通过org.apache.ibatis.type.TypeHandlerRegistry进行注册，比如对于日期型数据的typeHandler，
  • 上传下载文件rz,sz命令 bitcarter linux命令rz
    刚开始使用rz上传和sz下载命令： 因为我们是通过secureCRT终端工具进行使用的所以会有上传下载这样的需求： 我遇到的问题： sz下载A文件10M左右，没有问题 但是将这个文件A再传到另一天服务器上时就出现传不上去，甚至出现乱码，死掉现象，具体问题 解决方法： 上传命令改为;rz -ybe 下载命令改为：sz -be filename 如果还是有问题： 那就是文
  • 通过ngx-lua来统计nginx上的虚拟主机性能数据 ronin47 ngx-lua　统计 解禁ip
    介绍 以前我们为nginx做统计,都是通过对日志的分析来完成.比较麻烦,现在基于ngx_lua插件,开发了实时统计站点状态的脚本,解放生产力.项目主页: https://github.com/skyeydemon/ngx-lua-stats 功能 支持分不同虚拟主机统计, 同一个虚拟主机下可以分不同的location统计. 可以统计与query-times request-time
  • java-68-把数组排成最小的数。一个正整数数组，将它们连接起来排成一个数，输出能排出的所有数字中最小的。例如输入数组{32, 321}，则输出32132 bylijinnan java
    import java.util.Arrays; import java.util.Comparator; public class MinNumFromIntArray { /** * Q68输入一个正整数数组，将它们连接起来排成一个数，输出能排出的所有数字中最小的一个。 * 例如输入数组{32, 321}，则输出这两个能排成的最小数字32132。请给出解决问题
  • Oracle基本操作 ccii Oracle SQL总结Oracle SQL语法Oracle基本操作Oracle SQL
    一、表操作 1. 常用数据类型 NUMBER(p,s)：可变长度的数字。p表示整数加小数的最大位数，s为最大小数位数。支持最大精度为38位 NVARCHAR2(size)：变长字符串，最大长度为4000字节（以字符数为单位） VARCHAR2(size)：变长字符串，最大长度为4000字节（以字节数为单位） CHAR(size)：定长字符串，最大长度为2000字节，最小为1字节，默认
  • [强人工智能]实现强人工智能的路线图 comsci 人工智能
        1：创建一个用于记录拓扑网络连接的矩阵数据表      2:自动构造或者人工复制一个包含10万个连接(1000*1000)的流程图      3：将这个流程图导入到矩阵数据表中      4：在矩阵的每个有意义的节点中嵌入一段简单的
  • 给Tomcat，Apache配置gzip压缩(HTTP压缩)功能 cwqcwqmax9 apache
    背景： HTTP 压缩可以大大提高浏览网站的速度，它的原理是，在客户端请求网页后，从服务器端将网页文件压缩，再下载到客户端，由客户端的浏览器负责解压缩并浏览。相对于普通的浏览过程HTML ,CSS,Javascript , Text ，它可以节省40%左右的流量。更为重要的是，它可以对动态生成的，包括CGI、PHP , JSP , ASP , Servlet,SHTML等输出的网页也能进行压缩，
  • SpringMVC and Struts2 dashuaifu struts2springMVC
    SpringMVC VS Struts2 1: spring3开发效率高于struts 2: spring3 mvc可以认为已经100%零配置 3: struts2是类级别的拦截， 一个类对应一个request上下文， springmvc是方法级别的拦截，一个方法对应一个request上下文，而方法同时又跟一个url对应 所以说从架构本身上 spring3 mvc就容易实现r
  • windows常用命令行命令 dcj3sjt126com windowscmdcommand
    在windows系统中，点击开始－运行，可以直接输入命令行，快速打开一些原本需要多次点击图标才能打开的界面，如常用的输入cmd打开dos命令行，输入taskmgr打开任务管理器。此处列出了网上搜集到的一些常用命令。winver 检查windows版本 wmimgmt.msc 打开windows管理体系结构(wmi) wupdmgr windows更新程序 wscrip
  • 再看知名应用背后的第三方开源项目 dcj3sjt126com ios
    知名应用程序的设计和技术一直都是开发者需要学习的，同样这些应用所使用的开源框架也是不可忽视的一部分。此前《 iOS第三方开源库的吐槽和备忘》中作者ibireme列举了国内多款知名应用所使用的开源框架，并对其中一些框架进行了分析，同样国外开发者 @iOSCowboy也在博客中给我们列出了国外多款知名应用使用的开源框架。另外txx's blog中详细介绍了 Facebook Paper使用的第三
  • Objective-c单例模式的正确写法 jsntghf 单例iosiPhone
    一般情况下，可能我们写的单例模式是这样的： #import <Foundation/Foundation.h> @interface Downloader : NSObject + (instancetype)sharedDownloader; @end #import "Downloader.h" @implementation
  • jquery easyui datagrid 加载成功，选中某一行 hae jqueryeasyuidatagrid数据加载
    1.首先你需要设置datagrid的onLoadSuccess $( '#dg' ).datagrid({onLoadSuccess :  function (data){      $( '#dg' ).datagrid( 'selectRow' ,3); }});   2.onL
  • jQuery用户数字打分评价效果 ini JavaScripthtmljqueryWebcss
    效果体验：http://hovertree.com/texiao/jquery/5.htmHTML文件代码： <!DOCTYPE html> <html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml"> <head> <title>jQuery用户数字打分评分代码 - HoverTree</
  • mybatis的paramType kerryg DAOsql
    MyBatis传多个参数： 1、采用#{0},#{1}获得参数：    Dao层函数方法：     public User selectUser(String name,String area); 对应的Mapper.xml    <select id="selectUser" result
  • centos 7安装mysql5.5 MrLee23 centos
    首先centos7 已经不支持mysql，因为收费了你懂得，所以内部集成了mariadb，而安装mysql的话会和mariadb的文件冲突，所以需要先卸载掉mariadb，以下为卸载mariadb，安装mysql的步骤。   #列出所有被安装的rpm package rpm -qa | grep mariadb   #卸载 rpm -e mariadb-libs-5.
  • 利用thrift来实现消息群发 qifeifei thrift
               Thrift项目一般用来做内部项目接偶用的，还有能跨不同语言的功能，非常方便，一般前端系统和后台server线上都是3个节点，然后前端通过获取client来访问后台server，那么如果是多太server，就是有一个负载均衡的方法，然后最后访问其中一个节点。那么换个思路，能不能发送给所有节点的server呢，如果能就
  • 实现一个sizeof获取Java对象大小 teasp javaHotSpot内存对象大小sizeof
       由于Java的设计者不想让程序员管理和了解内存的使用，我们想要知道一个对象在内存中的大小变得比较困难了。本文提供了可以获取对象的大小的方法，但是由于各个虚拟机在内存使用上可能存在不同，因此该方法不能在各虚拟机上都适用，而是仅在hotspot 32位虚拟机上，或者其它内存管理方式与hotspot 32位虚拟机相同的虚拟机上 适用。     
  • SVN错误及处理 xiangqian0505 SVN提交文件时服务器强行关闭
    在SVN服务控制台打开资源库“SVN无法读取current” ---摘自网络 写道 SVN无法读取current修复方法 Can't read file : End of file found 文件：repository/db/txn_current、repository/db/current   其中current记录当前最新版本号，txn_current记录版本库中版本
按字母分类： ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ其他