生物医学光子学中的共聚显微技术光学相干层析技术（一）

姓名：龚楚鸿 学号：20181214379

原创

【嵌牛导读】本文灵感来源于杨老师嵌牛团队的“健康社区”，对于将康及嵌入式系统来说，生物医学光子学也是一个非常重要的交叉学科。本文将主要介绍两个较为火热的课题，共聚显微技术与光学相干层析技术（OTC）本文为该话题第一部分主要讲解共聚显微技术。

【嵌牛鼻子】生物医学光子学，光学系统

【嵌牛提问】光学系统与嵌入式的结合将会迸发出哪些火花？

【嵌牛正文】

0引言

        共聚焦显微成像技术（CMTF）和光学相干层析技术（OTC）都是近十几年来迅速发展起来的高新研究技术。两者的发展前景非常好，现在有些技术也已经运用到生活当中了。共聚焦显微成像技术在细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中已经得到了应用。而光学相干层析技术则在血流测速、青光眼诊断等已经有了较为完善的医学实践。本文将从教材出发结合大量文献资料按照课题4（叙述 OCT 和共聚焦显微成像的原理和医学应用，并分析其和普通光学显微镜之间的差别）的要求，分CMTF的原理及医学应用、OCT的原理及医学应用、两者与普通光学显微镜的差别三个部分来展开叙述。

1共聚焦显微成像技术（CMTF）的原理及医学应用

1.1共聚焦显微成像技术（CMTF）的原理

        首先我们对共聚焦显微成像及背景有一个简要的了解：共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种。共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势，可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。由于全反射荧光显微成像方法只能对界面附近很薄的一层样品进行成像，对于具有一定厚度的生物样品则不适用。故而出现了激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM），可以对厚样品进行三维成像，同时在纵向可以获得传统宽场显微成像技术不可比拟的分辨率并广泛应用在现代光学显微成像技术中。接下来阐述其原理。

        共聚焦显微成像的原理是由神经网络计算及人工智能专家Marvin Minsky在1957年其发表的专利中提出。共聚焦显微成像引入了“扫描”和“共聚焦”两个关键技术。两者使得成像过程中能对焦平面以外的信号进行抑制，从而得到较高的图像信噪比和纵向分辨率。先说“扫描”：扫描成像采用经过物镜聚焦的激光光斑来照明样品，采用点探测器获取该点强度信息，并通过逐次改变样品和光斑的相对位置实现对样品的逐次扫描，最后通过软件合成为一张完整的图像；所谓“共聚焦”，指的是照明光源、物方焦点、像方焦点处的针孔三者在光学上互为共轭关系。在被照明的物点（物方焦点）共轭位置（像方焦点）设置一个尺寸很小的探针，使得只有从物方焦点发出的荧光才能通过探针孔被探测器接收到，而物方焦点以外（包括焦平面以外的其他层面）的荧光信号将被针孔滤除。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。原理图见图1、图2。

图1 CMTF结构图

图2 CMTF原理图

       该方法减少了相邻荧光的干扰并在一定程度上提高了横向分辨率，更极大程度地降低了物方非焦平面处荧光信号的干扰，从而提高了图像信噪比和纵向分辨率。除此之外，通过逐次移动焦平面的方式可以获得样品中不同层面的信息，从而实现“光学切层”（optical sectioning）再经过软件处理便可得到样品的三维图像。如今，随着技术的发展，新型的激光器也被应用其中，例如波长能够在很大范围内任意选取的“白激光”。此外，为了提高共聚焦显微系统的分辨率，提出了许多成像技术，如优化光路中的针孔、不同尺寸针孔获得图像相减等技术。由我国中科院研制CCD探测型共聚焦显微成像用CCD取代传统共聚焦成像中的针孔和点探测器，选取点扩展函数分布区域中一定组合的CCD像元合成等效针孔，在合成针孔为不同尺寸时分别比较系统的横向分辨率，得到优化的合成针孔，通过对不同合成针孔获得的图像加权相减，实现消减成像，进一步提高横向分辨率。得出：当合成针孔尺寸为艾里斑直径0.8倍时（８×８pixel），扫描图像同时具有较高的横向分辨率和信噪比；当用优化针孔（８pixel×８pixel）与较大针孔（１０pixel×１０pixel）图像加权相减时，权重系数取０．６时获得的消减图像横向分辨率相对于优化针孔图像提高了21.7％。CCD探测型共聚焦成像方法大大降低了传统共聚焦成像系统的装调难度，通过选取优化的合成针孔并进行消减成像可以提高成像的横向分辨率。图3为CCD探测型共聚焦系统原理示意图，图4为CCD探测型共聚焦实验系统图。

图3 CCD探测型共聚焦系统原理示意图

图4 CCD探测型共聚焦实验系统图

1.2共聚焦显微成像技术（CMTF）的医学应用

        CMTF如今在医学中有着广泛的应用，而这部分在教材中几乎并未出现。接下来将距离列举一些共聚焦显微成像技术的应用。

        有一种深入成像装置是一种紧凑、低成本、简单的激光扫描显微镜具有良好的生物医学成像应用前景。在850纳米操作时，它提供了一个理想的操作平台、无创和体内成像的软生物组织。是结构示意图如图5。

图5 结构示意图

        在组织清除和人造骨骼肌的实验中，使用共聚焦显微成像技术来观察组织的变化。选取最适合的方法，为未来人造组织提供了非常好的研究手段。下图（图6）为实验中的共聚焦显微成像的实验图像。

图6，老鼠的GFP聚焦显微成像的实验图像

        共聚焦显微成像技术以及其组合技术很有前景运用到癌症的相关诊断和治疗。SIMS（二次粒子质谱技术）和共聚焦显微成像技术联用，可以研究癌细胞相关靶向治疗效果。如图7。

图7，人源宫颈癌HeLa 细胞的LSCM （A,C,E,G）和ToF-SIMS（B,D,E,H） 联用成像图

        消化系统瘤非常常见，也是肿瘤类的主要类型，所以如何能够尽早的诊断和治疗（判断病情）显得尤为重要。所以产生了这样的一种新型方——共聚焦激光显微内镜联合荧光靶向探针诊断消化道肿瘤及癌前病变。利用CLE技术可以对结肠癌组织进行特异性成像，使在体诊断结肠癌成为可能。对人类癌症起到重要作用的生长因子受体2（HER2）进行靶向观测和研究。血管内皮生长因子(VEGF)是胃肠道肿瘤靶向治疗的靶点，在正常组织和肿瘤组织的血管生成中扮演重要角色，故而也成为勒该方案的一个观察对象。

        肝脏是机体新陈代谢和解毒的重要器官，也被视为一个免疫器官．解析肝脏免疫基本特性和功能，对防治肝脏疾病以及全身性相关疾病具有重要意义。由本书主编骆清铭教授等进行的肝脏免疫的活体显微光学成像研究，其中也用到了该技术，该研究中使用了转盘共聚焦显微成像，图8为肝脏成像窗口模型图片。

图8，肝脏成像窗口模型

        除了以上的还有在皮肤病上的应用——皮肤反射式共聚焦显微成像扫描畸变校正。以及对神经元钙离子的测定等等。可以说就目前而言医学应用范围一般在细胞学范畴，还有很大的发展和改进空间。