2022-03-10

Nat Med | 抗PD-1治疗黑色素瘤临床反应和免疫相关不良事件的肠道微生物群特征

原创 huacishu 图灵基因 

收录于话题#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=53.44

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者分析了患者治疗前的肠道微生物群组成与接受抗PD-1抑制剂治疗后的临床效果，通过计算机建模技术确定哪些细菌与更好的治疗反应或更差的治疗反应相关；

2、作者发现与有利反应相关的细菌仅限于放线菌门和厚壁菌门毛螺菌科、瘤胃菌科的物种；而革兰氏阴性菌与炎症宿主肠道基因特征、血液中性粒细胞与淋巴细胞的比例增加以及不良结果有关。

美国国家癌症研究所Giorgio Trinchieri教授课题组在国际知名期刊Nat Med在线发表题为“Intestinal microbiota signatures of clinical response and immune-related adverse events in melanoma patients treated with anti-PD-1”的论文。大量证据表明，肠道微生物组是一种与抗程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）治疗的抗肿瘤反应相关的肿瘤外源性因素，但已发表的与临床结果相关的微生物特征之间存在着不一致。为了解决这个问题，作者评估了一个新的黑色素瘤队列，以及四个已发表的数据集。事件时间分析显示，在开始治疗后约1年，微生物群组成与临床结果相关性最佳。综合数据分析和其他生物信息学分析表明，与良好反应相关的细菌仅限于放线菌门和厚壁菌门。相反，革兰氏阴性菌与炎症宿主肠道基因特征、血液中性粒细胞与淋巴细胞比率增加和不良预后相关。两种微生物标志物分别与有利和不利的临床反应以及明显的免疫不良反应相关，它们富集于漆树科和链球菌科。尽管队列间存在异质性，但在批量校正的微生物组数据上训练的监督学习算法一致地预测了所有队列中程序性细胞死亡蛋白-1治疗的结果。地理上分布不均匀的肠道微生物群落（微生物类型）与有利和不利结果相关，导致队列之间的差异。作者的发现为肠道微生物组与癌症免疫治疗反应之间的复杂相互作用提供了新的线索，为未来的研究提供了依据。

为了估计肠道微生物组组成与临床结果最大相关的时间，使用分类相对丰度计算置换多变量方差分析（PERMANOVA），比较治疗开始后不同时间点的非进展者（NPs）和进展者（Ps）（图1a）。微生物群组成反映了9-10个月时Ps和NPs之间的最大分离（图1a，b）。NPs中差异最丰富的物种是瘤胃球菌、布劳特氏菌、直肠杆菌和大粒瘤胃球菌。Ps表现出Prevotella spp.、Oscillibacter spp.、Alistipesspp.和Sutterellaceae spp.的丰度增加。（图1c）。为了估计每个分类单元的无进展生存期（PFS）概率，作者根据Kaplan–Meier曲线确定的粪便细菌丰度的最佳截止值，将患者分为高/低组。在单独使用抗PD-1（49名患者）或抗PD-1联合聚乙二醇化干扰素（peg-IFN；14名患者）治疗的队列中，与Ps或NPs相关的分类群基本一致（图1c），表明peg-IFN不影响相关性，因此对组合结果的分析增加了样本量和观察到的差异的显著性。P-LSC患者（主要是长期NPs）的微生物组群不能预测粪便收集后的进展。P-LSC患者的粪便微生物组与P-ESC队列中的Ps显著不同，与NPs相似（图1c）。这些数据表明，在治疗期间，有益的微生物组特征被保存在长期的NPs中。事实上，使用Cox回归确定的与PFS正相关或负相关的分类群，利用手动训练预测临床反应的模型，在训练早期和独立后期队列中观察到相似的曲线下面积（AUC；~90%）。

为了评估肠道微生物组对宿主组织的影响，对用于微生物组分析的粪便样本进行了转录组学分析。在26个样本中确定了约2000个宿主基因，每个样本的表达量>10次，并进一步比较了Ps和NPs。编码促炎细胞因子（IL1B和CXCL8）、转录因子（NFKBIZ、NFKBIA、TNFAIP3和LITAF）和超氧化物歧化酶（SOD2）的基因在Ps中增加，而NPs表现出编码粘膜和内毒素保护膜粘蛋白（MUC13和MUC20）和载脂蛋白（APOA1、APOA4和APOB；图2a）的基因表达增加。对差异表达宿主基因的上游调节器进行的通路分析表明，LPS是Ps促炎症基因特征的主要贡献者（图2b）。基因集富集分析（GSEA）预测，Ps和NPs粪便样本中最丰富的细胞类型是肠上皮细胞。Ps粪便样本中的炎性细胞（树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；图2c）也有所增加。为了研究宿主和微生物之间的调节关系，创建了一个统计模型，用于研究NLR、PFS、宿主基因表达和微生物类群和基因之间的相互作用，由684个节点和10040个边缘组成（图2d）。首先，与随机生成的组学类型相比，该网络在表型和其他组学类型之间具有明显更多的优势（图2e）。其次，与宿主基因和微生物基因相比，微生物与表型的连接性最强（图2e）。综上所述，网络询问显示微生物（分类群和基因）和宿主基因与表型密切相关，微生物成分的连接性高于人类基因。无益处的微生物对PFS和NLR的影响更大，所有微生物和人类表型（即PFS和NLR）之间的二分介数中心性（Bi-BC）得分更高（图2f）说明了这一点。有益微生物和无益微生物之间的平均淋巴结程度没有显著差异（图2g）。总的来说，作者的研究结果提示，富含革兰氏阴性菌的不良肠道微生物群可能会促进肠道内以LPS为主的炎症信号，导致全身炎症，表现为NLR升高和抗PD-1反应不良。

任何时候出现的免疫相关不良事件（IrAE）都与不同的粪便微生物群组成有关（图3a）。两个对抗PD-1反应具有相反作用的分类群（链球菌属）与IRAE相关（图3b）。排除时间偏差（由于PFS增加，有利分类群与IRAE之间的人为关联，因此在所述分类群丰度较高的患者中发生IRAE的概率更高），使用标志性时间点重新分析了微生物分类群与irAE的关联，并确认了irAE与几种衣原体科属之间的关联。患者根据预处理微生物组样本中链球菌属的丰度发展出不同的irAE谱图（图3c）。七种链球菌累积丰度最高的八名患者均出现了病毒性肝炎（图3c）。分析不同细菌与单个IRAE的关联，将特定细菌与不同IRAE的发生联系起来（补充图5）。与链球菌丰度较低的患者相比，链球菌丰度较高的患者PFS显著缩短（图3d）。链球菌的高丰度与治疗期间PPI的使用有关（图3e），而PPI的使用又与PFS的恶化有关。PPI的使用也与相关的肠道细菌的存在相关，如链球菌属。作者的研究发现，在PD-1治疗的黑色素瘤中，两种微生物特征与不同的irAE谱相关。如前所述，他们还将PPI的使用与粪便微生物群的组织化以及抗PD-1治疗的不良后果联系起来。

为了剖析分类水平对PD-1反应的贡献，通过线性判别效应大小（LEfSe）分析对批量校正的混合微生物群数据进行监督比较。选择性富集NRs的生物体主要属于Prevotellaceae, Rikenellaceae, Porphyromonadaceaeand Bacteroidaceae家族（图4a）。为了在非批次校正数据中确认这些关联，通过结合来自五个队列的Rs和NRs中选择的细菌之间的研究水平分析，进行了两种类型的分析（图4b）。这些分析确定了许多先前描述的与PD-1治疗反应相关的分类群。在Rs中，属于拉克诺菌科几个属的分类群和包括双歧杆菌属在内的放线菌门占优势，而拟杆菌中的多个普氏杆菌属在NRs中富集。差异存在的微生物基因主要反映了分类上的差异，导致识别出特定于类群的基因，而不是可能影响宿主反应的基因（驱动基因）。值得注意的是，在不同的分类群中发现了与宿主反应相关的类似基因特征，这表明复杂微生物群落中的未知变异排除了可靠的特征识别。作者观察到，分类鉴定物种中的亚种与临床结果存在差异。由于分类相似细菌的功能多样性在很大程度上取决于与这些功能相关的离散数量的基因的存在与否，作者试图消除分类共享基因的混杂效应，并确定可能参与调节表型的基因。对来自五个黑色素瘤患者队列的集合重叠群进行了参考独立分组分析。发现了13237个聚类，属于730个分类学已知单元，并鉴定了39480个基因。这种方法允许亚种水平的基因比较。非参数统计比较以物种——有利和不利分类群的基因网络（图4c，d）以及“度”统计（一个基因共享的物种数量）的形式呈现。在有利的分类群中，作者发现与多糖脱乙酰化相关的基因丰度增加，已知这些基因在免疫逃避中发挥作用，以及铁转运和铁诱导的活性氧产生，这些活性氧影响粘膜愈合。作者还观察到编码黄素和核黄素代谢的基因丰度增加，其副产物可由MR1呈现，并被粘膜相关不变T细胞识别，作者发现，在FMT后PD-1反应性患者中，这些细胞被激活。相反，在不利的分类群中，编码与LPS合成和粘液降解相关酶的基因，如α-l-岩藻糖苷酶和α-半乳糖苷酶增加。

为了评估在宏基因组数据集上训练的机器学习模型是否能够预测PD-1反应，作者使用了三种机器学习模型：随机森林（RF）、广义线性模型（GLM）和多项式支持向量机（poly-SVM）。使用70:30的训练-测试分割对单个数据集进行分析，结果显示，没有队列的AUC>0.79是可变的，不同队列的交叉训练-测试也给出了AUC值在0.21到0.79之间的可变结果。对所有结果进行的分析证实，对组合的预测并不显著，而且模型未能预测临床反应，很可能是因为大多数队列规模较小。通过对批量校正的汇总数据和额外的训练步骤（方法）进行交叉验证，作者发现AUC值在0.54和1.00之间，在15种组合中有12种组合的临床反应预测具有显著（P<0.05）的准确性；分析证实，当使用无关队列的微生物群数据进行训练时，每种学习方法都能显著预测临床反应（P<0.01）（图5a，b）。

人类肠道微生物群包括多个离散的生态平衡群落，下文称为“肠道微生物群”——它们可以通过饮食、药物和生活方式进行修改。虽然许多研究将个体分类群与结果联系起来，但对肠道微生物型与抗PD-1反应之间的关系知之甚少。作者观察到，在五个黑色素瘤队列中鉴定出的有利和不利细菌在不同的集群中分离。为了定义这些簇，统一分析了来自美国肠道项目（AGP）的16S rRNA基因扩增子数据和来自四个独立黑色素瘤队列的PD-1治疗黑色素瘤患者（图6a）。定义了27种不同的微生物类型（图6a）。一些是不同的（例如，簇9和簇19），而另一些（例如，簇13和簇27）与相邻簇有重叠的特征。与人类微生物群中已报道的肠道类型一致，作者确定了定义微生物类型的分类群，包括普雷沃菌属、阿克曼菌属和双歧杆菌属。将黑色素瘤患者的16S扩增子数据映射到AGP图谱，观察到四个队列的差异分布（图6b）。还观察到Rs和NRs具有非均匀分布（图6c）。通过计算每个簇中Rs与NR的比值（OR），Rs和NR被分离为具有不同响应概率的组成不同的有利和不利“超级簇”（图6d）。它们广泛地将微生物组成和临床反应之间具有相似相关性的微生物类型分组：两个富含有利分类群，两个富含不利分类群（图6e）。还计算了具有类似方向ORs的非随机分布概率（图6e）。使用方差分析（图6f）和线性判别分析（图6g）来评估差异最丰富的分类群。

总之，作者的发现在一个新的黑色素瘤队列和四个先前发表的队列中确定了与临床结果和IRAE相关的微生物特征。提供了新的数据支持肠道微生物组在促进慢性炎症和免疫抑制中的作用。研究结果表明，在接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者中，不同地理分布的微生物群可能优先与临床结果相关。作者的工作为未来的研究提供了参考，以确认在接受ICB治疗的大型前瞻性患者队列中的发现的相关性，并支持额外的临床前研究，以进一步了解肠道微生物组调节抗肿瘤免疫的机制。

教授介绍

Trinchieri博士于目前是高级研究员和综合癌症免疫学实验室主任。2016年，他获得了美国国立卫生研究院杰出研究员的称号。在加入NCI之前，Trinchieri博士是NIH寄生虫病实验室学者。他从意大利都灵大学获得医学博士学位。他在癌症研究中心的研究重点是炎症/先天性抵抗和适应性免疫之间的相互作用，以及促炎细胞因子在造血、先天性抵抗和免疫调节中的作用。1989年，他在威斯塔研究所（Wistar Institute）发现了白细胞介素-12。多年来，他一直在研究白细胞介素-12产生和作用的分子机制，以及该分子在肿瘤免疫、感染和自身免疫中的作用。

参考文献

McCulloch JA, Davar D, Rodrigues RR, et al. Intestinal microbiotasignatures of clinical response and immune-related adverse events in melanomapatients treated with anti-PD-1. Nat Med. 2022;10.1038/s41591-022-01698-2.doi:10.1038/s41591-022-01698-2