荧光定量PCR（二） — 引物与探针

1.引物设计的基本原则是什么？

引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
引物长度一般在15-30碱基之间。
引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72 ℃。
引物3’端要避开密码子的第3位。
引物3’端不能选择A，最好选择T。
碱基要随机分布。
引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物5’端和中间△G值应该相对较高，而3’端△G值较低。
引物的5’端可以修饰，而3’端不可修饰。
扩增产物的单链不能形成二级结构。
引物应具有特异性。

2.Tm值：

Tm值的概念：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA 变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的解链温度(Tm)。
长度为20 mer及以下的引物，Tm计算公式为： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC个数/引物总碱基数

3.常见引物修饰

修饰	说明
磷酸化Phosphorylation	5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
生物素Biotin	引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高新Digoxigenin	地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。
内部氨基修饰	主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶），目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修饰。
5'氨基修饰	可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
3'氨基修饰	目前提供3' C6 氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
巯基Thiol	5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
间臂 Spacer	Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强亲水基团。
硫代Phosphorthioate	硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
脱氧脲嘧啶DeoxyUridine，dU	脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。
脱氧次黄嘌呤 deoxyInosine，dI	脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。

4.如何保存引物？

引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。没有溶解的引物非常稳定，-20 ℃下可保存2-3年，甚至更长。溶解后的引物-20 ℃下避免反复冻融，可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD值较大，建议将溶解好的引物事先稀释为100 μmol/L的储存液，分装数份保存于-20 ℃冰箱。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/μl或20 pmol/μl）后进行实验。修饰荧光引物需要避光保存。

5.引物在常温下运输，会降解吗？

不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

6.如何溶解引物？

干燥后的引物质地非常疏松，开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，或管垂直向上在桌面上轻敲几次，将引物粉末收集到管底，防止开盖时引物散失。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10 mM Tris pH 7.5缓冲液，室温放置几分钟，上下混匀振荡，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH 4-5），引物在这种条件下不稳定。

7已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻融，并使用10 mM Tris pH 7.5缓冲液溶解引物。

8.TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150 bp），但不能与引物重叠。
长度一般为18-40 mer 。
G-C含量控制在40-80%左右。
避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
在引物的5'端避免使用G。
选用比较多的碱基C。
退火温度Tm控制在 68-70 ℃左右

9.合成的荧光标记探针应如何保存?

荧光探针必须避光保存。
干品可于-80℃保存一年以上,如无条件，请于-20℃保存。
强烈建议用RNase-free的TE (pH 8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/μl的储备液，分装成几份 (每份最多反复冻融5次)，于-20 ℃保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/μl或20 pmol/μl)，剩余部分于-20 ℃保存。