技术 | 单细胞转录组测序之10x Genomics

10X Genomics platform

10X Genomics 是一个综合的单细胞测序技术平台，可以应用于多种单细胞测序上，包括Single cell gene expression, Single cell Immune Profiling, Single cell CNV, Single cell ATAC。这篇文章将主要简述10X Genomics在单细胞基因表达检测方面，也就是scRNA-seq上的应用。

10X Genomics 一次测序可以捕捉100-80,000个细胞，具有极高的细胞通量。单细胞的测序通量平均也在50,000 reads/per cell 左右，而如果使用细胞核进行测序则平均通量为25,000 reads/per nuclei。比起使用FACS进行细胞分选的单细胞测序技术而言，10X Genomics的细胞通量有显著的提高。

10X Genomics Workflow

10X Genomics Workflow

1. 将样品组织/细胞分散成单细胞悬液
2. 在微流控系统中与sequencing beads形成GEMs
3. 在GEMs中细胞被裂解--建库
4. 进行文库测序
5. 下载数据进行分析（cellranger）

10X Genomics与其他测序技术的主要区别在于其barcode和建库的操作。虽然上样之后都是自动化操作，但了解其建库原理对后续的生物信息学分析也是有必要的。

• 细胞分选

  
  
  Cells sorting in 10X Genomics

10X Genomics运用微流控系统进行细胞分选，带有Barcode的Gel Beads 匀速地从左方进入，待分选的细胞和酶从下方以一定时间间隔进入，并与Gel Beads结合，进入油相中形成GEMs(Gel Bead in emulsion)

• Barcoding

  
  

Gel Beads上的Barcode带有一段每个细胞特异的UMI，在随后的文库构建中，只要是由该细胞扩增出的cDNA都会带上这段UMI以及前面的10x Barcode。因此，便可区分出不同细胞扩增出的cDNA。要注意的是，10X Genomics也是通过poly(dT)富集细胞的mRNA，会有无法避免的3‘ bias.

GEMs

一般而言，每个GEMs会形成如上图一般的结构，即一个细胞一个gel beads。但有时候也会出现一个GEM里有0或多个细胞(empty droplet or doublet)，对于这种GEMs则需要通过我们在后续分析中识别出来并进行排除。

• Library construction

  
  

形成GEMs后，细胞裂解后经过反转录(RT) —— cDNA generation 便形成cDNA文库。这一系列建库过程都在GEMs中发生，因此GEMs的存在相当于一个物理隔离，保证每个单细胞都在独特的“小室”中发生。另外，由于GEMs是在油相中形成了一种乳浊液(emulsion) 的形态 ，而乳浊液中会形成上万个微液滴，每一个微液滴就是一个GEMs，这也解释了为何10X Geonmics细胞通量如此之高的原因。

待测序的reads

建库完成后，采用Illumina的测序仪进行测序，通常进行双端不等长测序。其中5'测28nt检测barcode与UMI，3'测90nt用于定量基因表达。

最后，测序完成后，现在的10X Genomics测序仪会同时进行一些简单的数据分析，包括每个样品的数据量，mapping rate，data filtering ，每细胞reads等等。当然，我们也可以自己拿数据跑Cell Ranger，随后可以用seurat包等进行后续的个性化分析也是没有问题的。

优缺点

• 优点

  1. 细胞通量高，可达到80,000 cells/per run

  2. 可以进行单细胞和单细胞核测序

  3. 单细胞测序覆盖度高，平均为50,000 reads/per cell

• 缺点

  1. 存在一定doublet or empty droplet 的情况，导致部分数据不可用。

  2. 构建出3' cDNA文库，一方面存在3' bias。另一方面检测不到转录剪接等转录后加工事件。

以上就是对10X Genomics平台的简单介绍。

完。

参考文章：

https://www.10xgenomics.com/solutions/single-cell/
https://tgc.net.technion.ac.il/the-chromium-single-cell-gene-expression-solution/
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360000939852-What-is-the-difference-between-Single-Cell-3-and-5-Gene-Expression-libraries-