一文看懂三代组装软件——Flye

作者:童蒙
编辑:angelica

一、介绍

Flye是用于单分子组装数据的denovo基因组装的软件。这个软件可以用于各种数据集,从小的细菌到大的哺乳动物。

输入是原始的PacBio或者ONT的序列文件,输出是polished的contig。Flye同时也有针对微生物组装的模式。

二、安装和使用

安装非常简单~
conda install flye
使用的话,输入文件是FASTA或者FASTQ格式的,可以是gz压缩或者普通文本。对于raw的话,期望的错误率低于30%,校正之后序列的错误率低于3%,HiFi序列的低于1%。不过要记住,Flye最开始是基于raw reads开发的。

已经不需要提供基因组的大小,但是如果使用 --asm-coverage 则需要提供。

为了减少内存的消耗,可以使用最长的reads来进行初始化的disjointig的组装,使用--asm-coverage和--genome-size就可以了。一般而言,40x的深度已经足够了。

可以单独使用--polish-target进行结果打磨。

三、使用示例

  • 针对pacbio
    flye --pacbio-raw E.coli_PacBio_40x.fasta --out-dir out_pacbio --threads 4

  • 针对nanopore数据
    flye --nano-raw Loman_E.coli_MAP006-1_2D_50x.fasta --out-dir out_nano --threads 4

四、输入数据的类型

  • Oxford Nanopore:使用--nano-raw,ONT的数据错误率在5%-15%之间,尤其是在同聚物区域,错误率更高。

  • PacBio HiFi:使用--pacbio-hifi的参数来选择这个模式。期望错误率低于1%,我们也可以用--hifi-error这个参数来指定错误率,这样可以获得更完整的组装。

  • PacBio CLR:使用--pacbio-raw的参数,错误率在15%左右。注意的是,使用这个模式需要去除接头和分开多个passes。不过需要注意别拆分出了错误的序列。

  • error-corrected reads:可以使用--pacbio-corr 或者 --nono-corr这个参数,来支持校正后的序列,这个序列错误率应该小于3%。如果组装的结果比较碎,可能序列中的错误率比较高,这个时候可以考虑用raw reads。

  • 多个contig的一致性序列:使用--subassemblies来输入一系列的组装好的contig序列,这个可以用其他组装程序获得,期望的错误率小于1%。这样的话,用--iterations 0 可以来跳过polishing stage。

由于Flye可以直接使用raw reads,因此不需要前期的纠错。Flye会检测嵌合序列和低质量的序列,因此这个也不需要去除。然后,需要去除的是污染的序列。

五、参数描述

最小overlap长度
这个参数默认是reads N90,一般不需要设置。如果要设置,可以设置到3-5k。建议设置的越高越好,这样repeat graph就更少会纠缠,但是这样会产生更多的gap。
Metagenome mode
这个模式用于高度不均匀覆盖度的序列, 对于低至2x的覆盖度的区域也可以进行组装。在一些简单的metagenome中,使用普通的模式,会获得更多的长的序列,而用meta模式,序列会更加的片段化一些。对于复杂的metagenome,建议使用--meta模式。

Haplotype模式
默认的,Flye会合并graph中各种结构(bubbles、superbubbles、roundabout)等,来产生更长的一致性contig。使用--keep-haplotypes来保留更多的path,产生更细节的组装结果。

Trestle
Trestle是一个额外的模块,用于解析没有被read桥接的重复度是2的简单重复。根据数据集,它可能解析一些额外的重复,这对小的(细菌基因组)是有帮助的。使用--trestle选项来启用该模块。在大型基因组上,改善通常是最小的,但计算可能会花费大量时间。

覆盖度的降低
对于大基因组,当深度过高的时候,需要较高的RAM。因此可以使用--asm-coverage来选择特定的深度,一般而言使用30x比较合适。

打磨的迭代次数
程序的最后会进行polish。默认的只进行一次polish,进行多次polish会矫正更多的错误,如果设置为0,那么就不会进行polish。

六、结果输出

主要有三种输出文件:

  • assembly.fasta:最终的组装的结果
  • assembly_graph.gfa|gv:最终的repeat graph,不过edge序列会和contig的序列不一样,因为contig可能会包含额外的多个边。
  • assembly_info.txt:contig的额外的信息

每个contig就是图里一个唯一的边,同时这个唯一的contig也会进行两边延伸,来解决repeat区域。
因此,具有相同id的contig,会比相应的edge要长。这个同OLC算法的软件相似。
有时候,也会将contig基于repeat graph结构拼接成scaffolds。这些结果会输出成以scaffold_为前缀的文件。
尽管很难估计可靠的gap大小,一般默认是100个Ns。并且assembly_info.txt文件也会输出这些scaffold是怎么构建的信息。
assembly_info.txt示例如下


每列信息如下:

  • contig/scaffold id
  • 长度
  • 覆盖度
  • 是否是圈
  • 是否是重复
  • 重复度
  • Alternative group
  • 图的路径
    用??来代表scaffold的gaps,用*代表一个终止node。

七、性能比较

直接上图,看各个数据量大小下的资源情况。

八、算法说明

什么是repeat graph?
Flye算法使用repeat graph作为核心的数据结构,不同于de bruijn图需要精确的kmer的匹配,repeat graph可以构建相似的序列匹配,从而可以容忍较高的噪音。repeat graph的边代表基因组序列,顶点代表连接情况。所有的边要么是唯一的 ,要么是重复的。整个基因组通过遍历这个repeat graph,可以得到。因此unique的graph是只在遍历中出现一次。repeat graph可以用AGB或者Bandage进行可视化,如下所示。https://github.com/almiheenko/AGB https://github.com/rrwick/Bandage

Flye的主要流程
以下图为例,假设基因组A中有重复序列R1和R2,每个重复序列有2个拷贝,相似度为99%;同时还有四个唯一的片段A、B、C、D。

根据基因组获得和产生了一系列的序列(b),将这些序列进行进行拼接,拼接成disjointig(c),并将这些disjointig进行连接(d),构建连接后disjointig通过比对获得的repeat plot(e),并将repeat plot转换成repeat graph,即flye的核心数据结构(f),然后将序列比对到repeat graph上(g),最后根据比对结果,构建R1的两个拷贝和R2的两个拷贝。

repeat plot和repeat graph如何相互转换呢?
假设一条序列XABYABZBU,其中重复为AB,AB和B。根据局部的自身比对,可以画出如图a的共线性图。如果比对的终点在对角线的投影重合,那么分配为相通的颜色,例如下图a中的蓝色。将对角线上不同的点连接起来,形成线性的结构(b);将相同颜色的点合并到一起,形成图c,最后对图进行简化得到图(d)。

如何解决unbridge repeat?
假设有以下b的repeat graph,有两个拷贝的REP,长度为22kb,是处于unbridge的状态。为了获得REP的序列,我们首先或者IN1、IN2、OUT1和OUT2的接头序列,同时对IN1、IN2、OUT1和OUT2进行延申。对延伸后的IN1、IN2、OUT1、OUT2再次去寻找跨越全REP区域的序列,发现有13条和18条,这样,我们把所有的区域都解决了。

这次给大家介绍了Flye这个软件。大家继续关注,我们后续会推出更多其他软件。

参考文献

  1. https://github.com/fenderglass/Flye/blob/flye/docs/USAGE.md
  2. Kolmogorov, M., Yuan, J., Lin, Y. et al. Assembly of long, error-prone reads using repeat graphs. Nat Biotechnol 37, 540–546 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0072-8

你可能感兴趣的:(一文看懂三代组装软件——Flye)