【文献分享，IF=28.77】首次通过CyTOF揭秘体感系统发育图谱

据悉，身体感觉系统的精确控制发展对于检测疼痛、瘙痒、温度、机械触摸和身体位置是必不可少的。尽管体感神经元在成熟时已有较好的特征，但许多关于其发育的基本问题仍未解决。特别是，背根神经节（DRG）的中间祖细胞类型的特征仍然很差，控制细胞类型规范的分子图谱还没有定义。

近期，美国弗吉尼亚大学Eli R. Zunder和Christopher D. Deppmann研究团队利用CyTOF构建了躯体感觉多样化和成熟的发育图谱。该研究成果“A developmental atlas of somatosensory diversification and maturation in the dorsal root ganglia by single-cell mass cytometry”于2022年10月27日发表在国际一流学术期刊《Nature Neuroscience》。

为了研究体感发育过程中发生的蛋白质水平变化，研究人员利用CyTOF技术详细的描述了雌雄C57/BL6小鼠从胚胎(E)11.5天到出生后(P)4天发育的每一天DRG的组成。为了识别广泛的DRG细胞类型类别，研究人员检测了近300万个细胞，量化了所有时间点上30种分子上不同的体感胶质细胞和41种不同的神经元状态。对分化轨迹的分析显示，罕见的细胞共表达两个或更多Trk受体并过度表达干细胞标记物，表明这些神经营养因子受体在细胞命运指定中发挥作用。与以前基于RNA的研究相比，发现了许多蛋白质-mRNA对之间的显著差异，证明了蛋白质水平测量对识别细胞功能状态的重要性。总体而言，这项研究表明，CyTOF是一个高通量、可扩展的平台，可以快速对体感组织进行表型分析。

图1 CyTOF分析神经细胞流程

CyTOF鉴定从E11.5到P4的DRG细胞类型

为了通过DRG的蛋白质表达特征来识别和表征背根神经节中的细胞类型，研究人员首先采用了CyTOF分析神经组织的单细胞，观察到由于最初的增殖和迁移波，神经元的相对丰度在E16.5之前增加，然后由于细胞凋亡和神经胶质前体细胞的同时增加而减少；神经元、卫星胶质细胞（SGCs）、可能的吞噬胶质前体细胞和雪旺细胞在整个时间过程中的比例对应于神经元增殖和神经胶质亚型扩张的预期窗口。

图2 CyTOF鉴定从E11.5到P4的DRG细胞类型

神经胶质细胞亚型及其发育轨迹

为了进一步研究胶质细胞如何在DRG中成熟，研究人员选择了所有表达胶质的标记，鉴定了四种不同的胶质细胞类型：雪旺细胞、SGCs、未指明的胶质前体细胞和可能的吞噬胶质前体细胞。神经胶质前体到达背根神经节，并在E13.5开始包裹体感神经元胞体和吞噬死亡神经元；雪旺细胞(CD9+和Sox2low)在出生前后出现，并迅速扩展为两种不同的类型：未成熟/无髓鞘和成熟/髓鞘，这些亚型并不是简单地从不成熟/无髓鞘(cluster2、4和5)过渡到成熟/有髓岛(cluster1、3、6和7)，这表明不同的岛屿可能是在同一种群的非髓鞘和髓鞘池之间划定的，而不是发育谱系或成熟状态的差异；吞噬细胞胶质前体共表达非髓鞘胶质标记，但也包含神经元标记，未成熟的胶质前体被鉴定为吞噬神经元碎片。

图3  神经胶质细胞亚型表现出不同的发育轨迹

感神经元亚型及其发育轨迹

为了进一步研究DRG中的神经元亚型，研究人员提取了所有表达TuJ1、NeuN、Islet1、PGP9.5和/或MAP2的簇，并在这个细胞亚集上执行了额外一轮的聚类，分为三个主要组：TrkA+Ret+，TrkB+和TrkC+。TrkA+Ret+亚型似乎出现在E11.5的三个未成熟群体(cluster1、2和3)，并分化为4种不同的亚型；TrkB+神经元分为两组：Aδ低阈值机械受体(Aδ-LTMR)和快速适应低阈值机械受体(RA-LTMRs)；TrkC+神经元分为两组：缓慢适应低阈值机械感受器(SA-LTMR)和本体感受器。

图4  不同的神经元亚型在发育过程中出现

TrkA+Ret+和TrkB+TrkC+谱系被认为是不同的特定前体细胞的不同迁移波，在神经棘中有一个共同的前体细胞。为了研究URD分支点的细胞命运决定，研究人员确定了TrkBTrkC和TrkARet URD中每个分支点的子片段之间蛋白质表达的最显著差异：TrkB和TrkC是区分TrkB+RA-LTMR和Aδ-LTMR与TrkC+SA-LTMR和本体感受器的关键标记，以及Runx3的关键标记。在TrkARet URD分支中，肽能和非肽能伤害性感受器之间的分裂对应于MAP2、N-Cadherin、p75NTR和c-Kit的表达差异，这表明肽能伤害性感受器比非肽能伤害性感受器成熟得更早。

图5  神经元分化的伪时间分析

由于Trk受体描绘了躯体感觉神经元的亚型，并将神经元的存活与靶点的适当神经支配联系在一起，因此研究了神经元是否可以在承诺特定的细胞命运之前同时瞬时表达两个或更多Trk，该分析揭示了一小群多Trk+神经元，它们同时表达两个或多个Trk受体。

图6  促生长和干细胞标志物升高的多Trk+神经元

DRG的CyTOF与RNA-seq分析数据比较

研究人员将CyTOF检测结果与scRNA-seq研究数据进行了比较，发现蛋白质表达与RNA表达密切相关，但对于大多数蛋白质-mRNA同源对，在表达水平相对趋势的时间上存在很大差异。研究人员还比较了群体水平上不同发育阶段的CyTOF和scRNA-seq DRG测量结果：通过CyTOF，三条不同的轨迹对应于TrkA/Ret、TrkB和TrkC；通过scRNA-seq，两条不同的轨迹对应于TrkA和TrkB、TrkC和Ret。在大量比较中，研究人员观察到了RNA和蛋白质水平密切跟踪的标记；RNA表达先于蛋白质的标记(所有细胞类型中的Islet1或TrkA+神经元中的CD44)；RNA水平迅速降低但蛋白质表达保持高水平的标记(所有细胞类型中的TuJ1或TrkC+神经元中的Runx3)；甚至蛋白质表达先于RNA水平的标记(例如，TrkB+神经元中的p75NTR)。与这些发现一致，研究人员观察到在选择用于IHC和RNAScope验证的两个同源对：TuJ1/TUBB3和TrkA/NTRK1中，蛋白质和mRNA水平之间存在相同的差异。

图7 CyTOF和scRNA-seq的DRG分析比较

文章总结

该项研究对雌雄C57/BL6小鼠的DRG进行了CyTOF实验，从胚胎第11.5天到出生后第4天每天收集数据。研究人员测量了近300万个细胞，量化了所有时间点上30种分子上不同的体感胶质细胞和41种不同的神经元状态。对分化轨迹的分析显示，罕见的细胞共表达两个或多个Trk受体和过表达干细胞标记物，这表明这些神经营养因子受体在细胞命运指定中发挥作用。与之前基于RNA的研究相比，发现了许多蛋白质- mRNA对之间的显著差异，证明了蛋白质水平测量对识别细胞功能状态的重要性。

总之，本研究表明，CyTOF是一个高通量、可扩展的平台，可以快速对体感组织进行表型分析。

【参考文献】Keeler AB, Van Deusen AL, Gadani IC, Williams CM, Goggin SM, Hirt AK, Vradenburgh SA, Fread KI, Puleo EA, Jin L, Calhan OY, Deppmann CD, Zunder ER. A developmental atlas of somatosensory diversification and maturation in the dorsal root ganglia by single-cell mass cytometry. Nat Neurosci. 2022 Nov.