目录
1.Module 1 - Introduction to RNA sequencing
- Installation
- Reference Genomes
- Annotations
- Indexing
- RNA-seq Data
- Pre-Alignment QC
2.Module 2 - RNA-seq Alignment and Visualization
- Adapter Trim
- Alignment
- IGV
- Alignment Visualization
- Alignment QC
3.Module 3 - Expression and Differential Expression
- Expression
- Differential Expression
- DE Visualization
- Kallisto for Reference-Free Abundance Estimation
4.Module 4 - Isoform Discovery and Alternative Expression
- Reference Guided Transcript Assembly
- de novo Transcript Assembly
- Transcript Assembly Merge
- Differential Splicing
- Splicing Visualization
5.Module 5 - De novo transcript reconstruction
- De novo RNA-Seq Assembly and Analysis Using Trinity
6.Module 6 - Functional Annotation of Transcripts
- Functional Annotation of Assembled Transcripts Using Trinotate
2.2 Alignment
HISAT2 alignment
用HISAT2比对基因组和转录组。
首先，为对齐结果创建适当的输出目录
mkdir align
HISAT2的输出是每个数据集的SAM/BAM文件。
参考HISAT2帮助手册获得更多说明：
- https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml
HISAT2基本用法:
#hisat2 [options]* -x {-1 -2 | -U | --sra-acc } [-S ]
额外参数如下:
'-p 8' tells HISAT2 to use eight CPUs for bowtie alignments.
'--rna-strandness RF' specifies strandness of RNAseq library. We will specify RF since the TruSeq strand-specific library was used to make these libraries. See here for options.
'--rg-id $ID' specifies a read group ID that is a unique identifier.
'--rg SM:$SAMPLE_NAME' specifies a read group sample name. This together with rg-id will allow you to determine which reads came from which sample in the merged bam later on.
'--rg LB:$LIBRARY_NAME' specifies a read group library name. This together with rg-id will allow you to determine which reads came from which library in the merged bam later on.
'--rg PL:ILLUMINA' specifies a read group sequencing platform.
'--rg PU:$PLATFORM_UNIT' specifies a read group sequencing platform unit. Typically this consists of FLOWCELL-BARCODE.LANE
'--dta' Reports alignments tailored for transcript assemblers.
'-x /path/to/hisat2/index' The HISAT2 index filename prefix (minus the trailing .X.ht2) built earlier including splice sites and exons.
'-1 /path/to/read1.fastq.gz' The read 1 FASTQ file, optionally gzip(.gz) or bzip2(.bz2) compressed.
'-2 /path/to/read2.fastq.gz' The read 2 FASTQ file, optionally gzip(.gz) or bzip2(.bz2) compressed.
'-S /path/to/output.sam' The output SAM format text file of alignments.
hisat2 -p 8 --rg-id=UHR_Rep1 --rg SM:UHR --rg LB:UHR_Rep1_ERCC-Mix1 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-ACTGAC.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 UHR_Rep1_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 UHR_Rep1_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/UHR_Rep1.sam
hisat2 -p 8 --rg-id=UHR_Rep2 --rg SM:UHR --rg LB:UHR_Rep2_ERCC-Mix1 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-TGACAC.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 UHR_Rep2_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 UHR_Rep2_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/UHR_Rep2.sam
hisat2 -p 8 --rg-id=UHR_Rep3 --rg SM:UHR --rg LB:UHR_Rep3_ERCC-Mix1 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-CTGACA.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 UHR_Rep3_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 UHR_Rep3_ERCC-Mix1_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/UHR_Rep3.sam
hisat2 -p 8 --rg-id=HBR_Rep1 --rg SM:HBR --rg LB:HBR_Rep1_ERCC-Mix2 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-TGACAC.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 HBR_Rep1_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 HBR_Rep1_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/HBR_Rep1.sam
hisat2 -p 8 --rg-id=HBR_Rep2 --rg SM:HBR --rg LB:HBR_Rep2_ERCC-Mix2 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-GACACT.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 HBR_Rep2_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 HBR_Rep2_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/HBR_Rep2.sam
hisat2 -p 8 --rg-id=HBR_Rep3 --rg SM:HBR --rg LB:HBR_Rep3_ERCC-Mix2 --rg PL:ILLUMINA --rg PU:CXX1234-ACACTG.1 -x INDEX/index --dta --rna-strandness RF -1 HBR_Rep3_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read1.fastq.gz -2 HBR_Rep3_ERCC-Mix2_Build37-ErccTranscripts-chr22.read2.fastq.gz -S align/HBR_Rep3.sam
注意:在上面的对齐中，我们将每个库视为一个独立的数据集。如果你有一个库的多个数据，你可以在一个HISAT2命令中将它们对齐在一起。要组合多个reads文件，您需要为'-1'输入参数提供所有read1文件作为逗号分隔的列表，然后为'-2'输入参数提供所有read2文件作为逗号分隔的列表，(其中两个列表的顺序相同):还可以使用samtool
SAM转换为BAM
将HISAT2 sam文件转换为bam文件，并按对齐位置排序
合并BAM文件
将所有UHR数据和所有HBR数据合并成一个BAM文件。注意:这可以通过几种方式来完成，比如“samtools merge”，“bamtools merge”，或者使用picard-tools(见下文)。我们选择第三种方法是因为它在合并bam头信息方面做得最好。注意:sambamba也保留头部信息。
cd align
java -Xmx2g -jar ../../picard.jar MergeSamFiles OUTPUT=UHR.bam INPUT=UHR_Rep1.bam INPUT=UHR_Rep2.bam INPUT=UHR_Rep3.bam
java -Xmx2g -jar ../../picard.jar MergeSamFiles OUTPUT=HBR.bam INPUT=HBR_Rep1.bam INPUT=HBR_Rep2.bam INPUT=HBR_Rep3.bam
计算对齐(BAM)文件，确保所有文件都成功创建(总共应该有8个)
ls -l *.bam | wc -l
8
ls *.bam
HBR.bam HBR_Rep2.bam UHR.bam UHR_Rep2.bam
HBR_Rep1.bam HBR_Rep3.bam UHR_Rep1.bam UHR_Rep3.bam
练习6
任务:对额外的数据集执行一些比对。用你在上面学到的技巧来对齐阅读。尝试使用HISAT2。还要练习将SAM转换为BAM文件，并合并BAM文件。
在练习3中创建的名为“practice”的单独工作目录中进行分析。
.sam和.bam文件之间有什么区别?
sam文件是一个纯文本序列比对映射文件。bam文件是相同信息的二进制压缩版本。
如果您像上面所做的那样对结果BAM文件进行排序，那么结果是否按read名称排序?还是position?
按照position排序
可以查看BAM文件的哪些列以确定排序的样式?
第一、第三和第四列包含reads名称、染色体和位置。
samtools view HCC1395_normal.bam | head | cut -f 1,3,4
可以使用什么命令仅查看BAM头?
samtools view -H HCC1395_normal.bam