高通量测序技术与转基因分子特征

高通量测序技术与转基因分子特征

以下文章来源于核酸检测科学前沿 ，作者hsjsqy20

近年来，随着测序技术的发展，基于高通量DNA测序技术的转基因植物分子特征分析为精准解析转基因植物的分子特征提供了新的思路

1、什么是分子特征？

所谓分子特征是指转基因植物中外源DNA片段在受体基因组中的整合情况：其中包括插入外源基因的拷贝数、插入位点的侧翼序列、插入序列的完整性、是否有载体骨架序列的插入、表达以及遗传稳定性等方面的信息。转基因植物分子特征分析是建立转基因植物精准检测技术的依据，也是转基因植物安全评价的主要内容和核心。

2、转基因植物分子特征分析方法有哪些？

目前，分析转基因植物分子特征的常用方法包括Southern杂交、实时荧光定量PCＲ、数字PCＲ、基于PCＲ的染色体步移技术，以及高通量测序技术。其中，Southern杂交、实时荧光定量PCＲ和微滴数字PCＲ是分析外源基因拷贝数的常用方法。

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3、传统的转基因植物分子特征分析方法的优缺点？

【Southern杂交】是当前转基因生物安全监管部门认可的分析方法，具有准确度高、 重复性好等优点，但无法正确分析同一位点插入多个拷贝的复杂情况，也无法明确插入片段是否有缺失或突变。

【qPCＲ】是一种相对定量分析外源基因拷贝数的方法，需要利用标准物质制定标准曲线，还需要选择已知拷贝数的基因作为参考基因，因此，结果易受引物和探针浓度、DNA纯度等因素的影响。

【数字PCＲ】操作流程相对简单，在测定过程中无需绘制标准曲线，且能实现了对外源基因的绝对定量。但存在对荧光探针的特异性要求高、成本高、微滴形成卡的通量低等不足。

【****基于PCＲ的染色体步移技术****】基于PCＲ的染色体步移技术包括TAIl-PCＲ
( thermal asymmetric interlaced)、反向PCＲ(inverse PCＲ)、连接介导的PCＲ( ligation-mediated PCＲ)、是分析转基因生物中外源基因测序序列的常用方法。利用这些方法，成功的获得了转基因大豆、玉米、棉花等转基因作物的侧翼序列。但这些技术在扩增过程中经常会产生非特异条带，不适合用于多位点插入转化事件的侧翼序列分析，而且当插入片段发生序列重排时，很难确定外源基因在受体生物基因组中的位置和插入片段的完整性。

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4、高通量测序技术解析转基因分子特征平台都有哪些？

目前可用于转基因测序分析的测序平台主要有Roche/455，Illumina HisSeq，Solid，Heliscope，以及三代测序平台PacBio SMRT，Nanopore纳米孔测序等等。不同的测序具有不同优势。

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5、基于高通量测序技术的转基因生物分子特征分析方法都有哪些？

（1）基于全基因组测序的转基因生物分子特征分析

通过对转基因生物进行基因组测序，然后利用载体DNA序列从测序数据中捕获外源插入DNA序列及外源DNA与受体基因组结合区序列，根据结合区序列分析转基因生物分子特征。

基于全基因组测序的转基因生物分子特征分析可用于分析转基因生物中外源插入序列的侧翼序列，也可以分析外源插入序列的拷贝数，是目前常用的分子特征分析方法。主要操作流程如下：

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（2）基于捕获测序的转基因生物分子特征分析

所谓捕获测序是指通过将基因组DNA片段化后，利用探针（根据转化载体的已知序列设计的）捕获目标DNA片段，富集后再进行测序的一项技术。

【T-DNA捕获测序】是利用T-DNA边界序列作为探针捕获T-DNA和基因组的结合区，然后通过测序获得外源DNA片段插入信息的一种技术。探针长度一般为70bp，5’端生物素化。

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【SBS(Southern by sequencing)捕获测序】是依据转化载体的DNA序列设计一系列带有标记的探针，利用这些探针与受体基因组DNA片段杂交，对捕获到的DNA片段进行测序，通过分析结合区序列来确定外源基因在转基因生物基因组中的整合情况。

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6、总结

高通量测序技术具有通量高、成本低、标准化、精确度高等特点，在转基因生物分子特征分析应用广泛，并且测序数据已被美国、欧盟、加拿大等国家认可用于转基因生物安全评价。当前，在国家转基因生物新品种培育重大专项的多年资助下，复合性状、ＲNAi、基因编辑等新型转基因作物不断涌现，给转基因作物分子特征解析技术带来了新的挑战。将高通量测序技术应用于我国转基因生物分子特征解析，并在转基因生物安全评价接受测序数据是必然趋势。