cDNA_Cupcake处理Iso-Seq

该工具用于处理三代转录组（CCS）结果

具体请关注：

• https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki
• https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Cupcake:-supporting-scripts-for-Iso-Seq-after-clustering-step

如何获取高质量的转录本暂且跳过。。

1. 安装

• python 3.7
• BioPython
• bx-python
• Cupcake

## 创建一个环境
conda create -n cupcake
condo activate cupcake

## 安装所需工具
conda install -c bioconda Biopython bx-pyton cython -y

## 安装cupcake
git clone https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake.git
cd cDNA_Cupcake
python setup.py build
python setup.py install
## 可以将cupcake中的脚本复制过来使用即可。

2. Collapse 冗余 isoforms （基于基因组）

在test_data中有测试数据，即

• 转录本数据hq_isoforms.fa
• ref.fa
  ===========================================================
• 比对（可以选用minimap2(v2.9)或者gamp都可以，这里以minimap2为例子）

## 比对 
minimap2 -ax splice -t 20 -uf --secondary=no -C5 \
  ref.fa hq_isoforms.fa >hq_isoforms.sam 
## sort
sort -k3,3 -k4,4n hq_isoforms.sam  >hq_isoforms.sorted.sam 

• 利用cupcake中的脚本collapse_isoforms_by_sam.py 合并isoform

主要目的将冗余isoform以及未比对到ref上的isoform去掉。

基本用法

./collapse_isoforms_by_sam.py
usage: collapse_isoforms_by_sam.py [-h] [--input INPUT] [--fq] [-s SAM]
                                   [-b BAM] -o PREFIX [-c MIN_ALN_COVERAGE]
                                   [-I MIN_ALN_IDENTITY]
                                   [--max_fuzzy_junction MAX_FUZZY_JUNCTION]
                                   [--max_5_diff MAX_5_DIFF]
                                   [--max_3_diff MAX_3_DIFF]
                                   [--flnc_coverage FLNC_COVERAGE]
                                   [--gen_mol_count] [--dun-merge-5-shorter]
                                   [--cpus CPUS]
collapse_isoforms_by_sam.py: error: the following arguments are required: -o/--prefix

参数说明：
-i：默认0.95，相似度；
-c：默认0.99，coverage；
--max_5_diff： 5‘段外显子最大差异，默认100bp；
--max_3_diff： 3‘段外显子最大差异，默认100bp；
--dun-merge-5-shorter：不对5’端进行折叠，默认是进行折叠的

collapse_isoforms_by_sam.py   --input hq_isoforms.fa \
  -s hq_isoforms.sorted.sam -c 0.9 -i 0.9 \
  --dun-merge-5-shorter  --max_3_diff 500  \
  -o hq_isoforms.sorted

结果主要得到4个文件：
（1）hq_isoforms.sorted.collapsed.gff
（2）hq_isoforms.sorted.collapsed.rep.fq
（3）hq_isoforms.sorted.collapsed.group.txt

PB.1.1  transcript/3049
PB.1.2  transcript/19325
PB.2.1  transcript/2250,transcript/2632

uniq的PB.2.1是合并了两个isoform；
PB.1.1，PB.1.2表示这个位点有两个isoforms

（4）hq_isoforms.sorted.collapsed.ids.txt (剔除的序列，由于没有比对到ref或者具有较低的coverage和identity，对此可以适当调整-c和-I参数)

3. 对唯一的isoform进行定量

获得唯一的isoform后，可以基于之前cluster步骤中得到的cluster_report.csv，可以检测比对到isoform中的FL数量。

get_abundance_post_collapse.py hq_isoforms.sorted.collapsed cluster_report.csv

共获得2个结果文件

• hq_isoforms.sorted.collapsed.read_stat.txt

id      is_fl   stat    pbid
m64306_220512_094212/53741524/ccs       Y       unique  PB.6356.1
m64306_220512_094212/101909358/ccs      Y       unique  PB.6356.1
m64306_220512_094212/135922154/ccs      Y       unique  PB.5419.1
m64306_220512_094212/26542671/ccs       Y       unique  PB.5419.1
m64306_220512_094212/52037659/ccs       Y       unmapped        NA

包括FL read（id）以及对应的isoform（pbid）。

• hq_isoforms.sorted.collapsed.abundance.txt

# Field explanation
# -----------------
# count_fl: Number of associated FL reads
# norm_fl: count_fl / total number of FL reads, mapped or unmapped
# Total Number of FL reads: 153557
#
pbid    count_fl        norm_fl
PB.1.1  2       1.3024e-05
PB.1.2  2       1.3024e-05
PB.2.1  4       2.6049e-05

该文件，第二列就是唯一的isoform所对应的FL数量。（默认唯一isoform最低有2个FL支持，当然也可以进行过滤，基于filter_by_count.py脚本，详见官方文档）。

4. 过滤掉降解的5’ isoform

基于脚本./filter_away_subset.py

在反转录获得cDNA时，容易出现5‘端降解的情况，这就导致存在多条isoform，其余序列均类似，只是5‘端降解，因此得以保留，该目的就是去除5’端降解的isoform。

例如下图中，isoforms PB10.1, PB10.2, PB10.3,PB10.4,PB10.5, PB10.6中，PB10.3,PB10.4,PB10.5, PB10.6均出现5‘端降解的情况，而经过过滤后，则只保留PB10.1, PB10.2。

过滤5'端降解的isoform

filter_away_subset.py hq_isoforms.sorted.collapsed 

主要获得3个结果
（1）hq_isoforms.sorted.collapsed.filtered.gff
（2）hq_isoforms.sorted.collapsed.filtered.rep.fq
（3）hq_isoforms.sorted.collapsed.filtered.abundance.txt

参考

• https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki
• https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Cupcake:-supporting-scripts-for-Iso-Seq-after-clustering-step