单基因泛癌+免疫浸润+实验sci思路。看完你也能轻松拿到4+以上

今天给同学们分享一篇单基因泛癌+免疫浸润+实验的生信文章“Comprehensive analysis of the correlation of the pan-cancer gene HAUS5 with prognosis and immune infiltration in liver cancer”，这篇文章于2023年2月10日发表在Scientific Reports期刊上，影响因子为4.6。

肝癌是全球癌症相关死亡的最常见原因之一，仍然是全球健康挑战，其发病率在全球范围内不断增长。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，约占所有病例的80%。乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精滥用以及摄入真菌代谢产物黄曲霉毒素B1是HCC的主要风险因素。

1. HAUS5表达的显著差异和HAUS5作为泛癌预后生物标志物的评估

作者使用GTEx数据集分析了正常组织中HAUS5的表达水平。如图1A所示，与其他组织相比，卵巢和睾丸组织的表达水平相对较高，而血液和肝脏组织的表达水平相对较低。作者从CCLE数据库下载了肿瘤细胞系的数据，并分析了多个肿瘤细胞中HAUS5的表达情况（图1B）。结果显示，HAUS5的表达水平通常升高，并且在不同组织来源的癌细胞系中存在显著差异（Kruskal Wallis检验P = 2e−49），这与TCGA数据库的分析结果一致，即大多数肿瘤组织的表达水平高于正常组织。为了进一步确定HAUS5的差异表达情况，作者分析了20种不同肿瘤和正常组织中的HAUS5 mRNA水平。如图所示。1C，HAUS5 mRNA水平在胶质母细胞瘤（GBM），脑低级别胶质瘤（LGG），肺腺癌（LUAD），结肠腺癌（COAD），乳腺浸润性癌（BRCA），食管癌（ESCA），肾乳头状细胞癌（KIRP），胃腺癌（STAD），前列腺腺癌（PRAD），子宫体内膜癌（UCEC），头颈部鳞状细胞癌（HNSC），肾透明细胞癌（KIRC），肺鳞状细胞癌（LUSC），肝细胞癌（LIHC），甲状腺癌（THCA），直肠腺癌（READ），膀胱尿路上皮癌（BLCA）和胆管癌（CHOL）组织中显著高于正常组织。由于某些癌症正常样本数量较少，作者将GTEx和TCGA数据集与log2（x + 1）表达值整合，并分析了27种癌症类型中HAUS5表达的差异。作者在肿瘤中发现了HAUS5的高表达，包括GBM、LGG、UCEC、宫颈鳞状细胞癌（CESC）、KIRP、COAD、STAD、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、BLCA、READ、胰腺腺癌（PAAD）、急性髓系白血病（LAML）和CHOL，但在LUAD、PRAD、皮肤切除性黑素瘤（SKCM）、THCA、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）和子宫肉瘤（UCS）中的表达低于正常水平（图1D）。

图1 HAUS5的差异表达

在确认HAUS5在大多数肿瘤中过度表达后，作者进一步探讨了HAUS5表达与泛癌症患者预后的关系。作者分析了33种肿瘤中基因表达与预后之间的关系。从图2A中，作者发现HAUS5表达显著影响多种癌症类型患者的生存期，包括肾上腺皮质癌（ACC）（p = 8.90E−04）、肾透明细胞癌（KIRC）（p = 2.70E−05）、低级胶质瘤（LGG）（p = 3.30E−09）、肝细胞癌（LIHC）（p = 1.90E−03）、间皮瘤（MESO）（p = 3.10E−03）、前列腺癌（PRAD）（p = 0.02）、直肠癌（READ）（p = 3.00E−02）、肉瘤（SARC）（p = 0.04）和胸腺瘤（THYM）（p = 0.02）。此外，HAUS5在READ和THYM中是低风险基因，而在其他类型的癌症中是高风险基因。考虑到随访期间可能存在非肿瘤死亡因素的可能性，作者分析了HAUS5表达与疾病特异性生存（DSS）之间的关系。在图2B中，高HAUS5表达与ACC（p = 1.20E−03）、KIRC（p = 2.90E−04）、LGG（p = 3.90E−09）、LIHC（p = 1.80E−04）、MESO（p = 1.20E−03）、PRAD（p = 5.10E−03）和甲状腺癌（THCA）（p = 0.04）患者的预后不良相关。就HAUS5表达与无病生存期（DFI）之间的关联而言，森林图（图2C）显示COAD（p = 0.02）、LGG（p = 0.03）、LIHC（p = 4.50E−04）和PRAD（p = 1.70E−04）患者高表达与不良预后相关。在ACC（p = 5.40E−03）、LGG（p = 7.10E−08）、LIHC（p = 5.80E−05）、MESO（p = 0.02）和PRAD（p = 3.40E−08）中，高HAUS5表达与较短的无进展生存期（PFI）显著相关（图2D）。从结果中作者发现，HAUS5与LIHC、LGG和PRAD中的所有四个生存指标显著相关，这表明HAUS5在多种肿瘤中发挥重要作用。

图2 基于SangerBox数据库，根据HAUS5表达的33种肿瘤的生存分析结果绘制了森林图

2. 高表达和临床相关性的HAUS5在LIHC中

作者使用R软件包对TCGA数据库中的419个样本进行了生物信息学分析，以验证LIHC在各种癌症中的发现。根据图3A，作者发现HAUS5 mRNA在LIHC样本（369例）中显著高于正常样本（50例），这与泛癌分析结果一致。图3B显示，HAUS5 mRNA的表达水平高于癌旁组织（n = 50）。图3C显示，GSE25097数据集分析验证了HAUS5表达差异。通过使用来自CPTAC和HPA数据库的临床标本，作者发现了正常和肿瘤组织中HAUS5的蛋白表达水平。根据图3D、E，与正常组织相比，肿瘤组织中HAUS5的表达水平相对较高，与mRNA结果相似。作者通过Kaplan-Meier生存曲线分析了HAUS5 mRNA表达与LIHC患者预后之间的关系，以探索HAUS5是否可以作为LIHC的预后生物标志物。研究结果表明，HAUS5表达高的患者在LIHC队列中的预后较差（OS：截断值=513，风险比（HR）=1）。52，p = 0.022；DSS：截断值 = 513，HR = 1.84，p = 0.0097；无复发生存期（RFS）：截断值 = 520，HR = 1.38，p = 0.055；无进展生存期（PFS）：截断值 = 513，HR = 1.44，p = 0.014）（图3F–I）。

图3 在肝细胞癌中，HAUS5的表达水平高且具有预后价值

为了确定HAUS5表达在肿瘤发展中的重要性，作者观察了HAUS5表达与LIHC的病理特征在Kaplan-Meier Plotter数据库中的相关性。HAUS5表达上调与男性患者的较差OS和PFS相关（OS HR = 1.68，p = 0.023；PFS HR = 1.69，p = 0.0041），以及女性患者（OS HR = 2.38，P = 0.0043）。具体而言，增加的HAUS5 mRNA表达与I + II期（OS HR = 2.63，p = 6.20E-05；PFS HR = 1.64，p = 0.014）的LIHC患者的较差OS和PFS相关。此外，作者发现2级（OS HR = 2.13，p = 0.0053；PFS HR = 2.02，p = 0.0051）患者的OS和PFS与HAUS5表达相关。HAUS5与无乙型肝炎病毒感染的患者的较差OS和PFS相关（OS HR = 1.73，p = 0.023；PFS HR = 2.75，p = 2.70E−05）。随后，作者使用UALCAN数据库探索了HAUS5在正常和肝细胞癌组织中根据不同的临床特征（如年龄、性别、种族、肿瘤分级、TNM分期和TP53突变状态）的表达差异。如图4A-F所示，作者的结果表明HAUS5表达与临床参数和肝癌发展密切相关。

图4 通过UALCAN数据库分析HAUS5表达水平与LIHC临床特征之间的关联

3. 构建一个预测肝细胞癌患者预后的诺莫图

根据OS单变量和多变量Cox回归分析，TNM分期和HAUS5表达显著相关（图5）。构建了一个整合年龄、性别、TNM分期和HAUS5风险评分的预测图（图6A）。总分通过将遗传评分、年龄、性别和TNM分期的分数相加来计算。预测3年和5年生存率的校准曲线表明，预测图所预测的生存率与实际生存结果密切相符。基于TCGA队列，3年预测图的AUC为0.74，5年预测图的AUC为0.77（图6B）。几乎重叠的参考线表明该模型准确无误（图6C、D）。

图5 TCGA-LIHC队列中HAUS5与其他临床参数与OS的单变量（a）和多变量（b）Cox回归分析的相关性

图6 构建和评估一个用于预测肝细胞癌患者3年和5年生存率的图表

4. 共表达基因和功能富集分析

基于TCGA-LIHC数据集，作者研究了低表达组和高表达组之间的差异表达基因（DEGs），以探究HAUS5的生物功能。富集的生物通路（BP）与发育相关，包括“核分裂”、“细胞器分裂”、“染色体分离”、“有丝分裂核分裂”和“核染色体分离”（图7A）。富集的细胞组分（CC）与“含胶原的细胞外基质”、“突触膜”、“凝缩染色体”、“染色体着丝粒区域”和“凝缩染色体着丝粒区域”相关（图7B）。在分子功能（MF）方面，DEGs主要富集在“通道活性”、“被动跨膜转运活性”、“信号受体激活活性”、“受体配体活性”和“离子通道活性”（图7C）。作者还进行了KEGG通路富集分析，结果显示高HAUS5表达主要与细胞周期、视黄酸代谢、药物代谢-细胞色素P450、PPAR和P53信号通路相关（图7D）。

图7 HAUS5的功能富集分析和共表达基因

 

LinkedOmics数据库被用来研究HAUS5共表达基因。如火山图（图7E）所示，4836个基因（深红色点）与HAUS5呈显著正相关，2730个基因（深绿色点）呈负相关（虚假发现率（FDR < 0.01）。图7F、G显示了与HAUS5正相关和负相关的前50个基因。此外，作者还创建了一个热图，显示了HAUS5与几个参与细胞周期调控的基因之间的相关性（图7H）。作为细胞增殖的潜在标志物，MCM2-7在DNA复制中起着重要作用，并与肝癌的进展和预后有关。PLK1是一个重要的细胞周期调控蛋白激酶，与HAUS5 mRNA表达呈正相关。如图7I-L所示，GSEA显示与HAUS5表达呈正相关的基因主要富集在DNA复制、细胞周期、同源重组和P53信号通路中。这些结果表明HAUS5与DNA复制和细胞分裂有关。

5. HAUS5表达与免疫浸润相关

通过将CIBERSORT算法应用于TCGA-LIHC队列的转录组，评估了肝癌患者的免疫细胞浸润水平（图8A）。随后，作者根据HAUS5的中位表达将样本分为不同亚组，并使用ssGSEA方法研究肝癌组织中28种免疫细胞的分布情况（图8B）。在低组中，有12种免疫细胞亚型（活化的CD8 T细胞、CD56dim自然杀伤细胞、效应记忆CD8 T细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、调节性T细胞和1型T辅助细胞）的HAUS5表达较高组别表达更高。结果显示，低HAUS5表达组具有更丰富的免疫浸润细胞，尤其是活化的CD8 T细胞和自然杀伤细胞。鉴于免疫治疗在LIHC患者中的临床应用的重要性，作者进一步探讨了HAUS5表达与免疫检查点的相关性。从图中可以看出 在作者的研究中发现，HAUS5的表达与大多数免疫调节靶点呈现不同程度的相关性（CCL14（r = -0.35，p = 5.02e-12），CXCL12（r = -0.372，p = 1.43e-13），KDR（r = -0.442，p = 2.2e-16），TMEM173（r = -0.428，p = 2.2e-16），PDCD1（r = 0.283，p < 0.001）和PDL1（r = 0.206，p < 0.001））。此外，作者还包括了369个肝细胞癌（LIHC）样本，检测到了突变。在图8D的瀑布图中，显示了前15个突变基因，其中189个（51.2%）LIHC患者具有不同颜色编码注释表示的体细胞突变类型。与HAUS5表达低的组相比，高表达组在LIHC中的前10个突变基因（包括TP53、BAP1、RB1、NBEA、DCHS1、MUC17、DNAH10、HECTD4、TSC2和LRRK2）中显著具有更多的突变。这些结果表明，HAUS5的表达与肝细胞癌中的免疫浸润相关。

图8 HAUS5表达与肿瘤微环境中的免疫浸润和突变相关

6. HAUS5的敲除显示出抑制肿瘤的效果

在体外试验中，作者通过qRT-PCR比较了HepG2和Huh7细胞系中HAUS5的基线表达水平，结果显示HepG2的HAUS5 mRNA表达高于Huh7（图9A）。作者使用siRNA在HepG2和Huh7细胞中敲低了HAUS5的表达，并通过qRT-PCR进行了验证（图9B）。作者使用CCK-8和集落形成实验评估了LIHC细胞的增殖情况。结果显示，HAUS5敲低显著抑制了细胞增殖（图9C、D）。不同处理组的细胞被接种到6孔板中。板上分别接种了1000个细胞（HepG2）或3000个细胞（Huh7）。细胞培养14天后固定，用吉姆萨染色后进行计数。结果显示，HAUS5敲低组的集落形成率显著低于对照组（图9E）。EdU实验表明，HAUS5敲低细胞中DNA复制受到了抑制（图9F）。作者的研究表明，抑制HAUS5的表达显著降低了肝癌细胞的增殖。

 图9 HAUS5基因敲低对细胞增殖的影响

总结

在这项研究中，通过生物信息学分析，将泛癌基因HAUS5确定为肝癌的一种新的预后标志物。作者进一步通过体外实验验证了抑制HAUS5表达可以抑制肝癌细胞的增殖。新的生物标志物的发现有望改善患者的生存率。然而，这项研究存在一些局限性。作者大部分的发现都是基于数据分析，未来需要进行更多的实验来进一步验证和探索潜在的机制。