2021-09-29

Nature Cancer | 放疗与免疫检查点阻断联合治疗非小细胞肺癌

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：60.716

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、放射治疗（RT）联合免疫检查点抑制剂（ICI）是治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的一种有前途的方案。本文确定了与ICIs联合使用时，特定剂量的RT可使NSCLC模型中的肿瘤消退并提高生存率。RT的免疫调节功能归因于活化的肺驻留Scgb1a1+ club细胞。

2、分泌突触体相关蛋白23的club细胞特异性敲除小鼠未能从联合治疗中获益，这表明club细胞分泌组发挥了关键作用。

3、本文鉴定了八种club细胞分泌蛋白，它们抑制免疫抑制的髓样细胞，减少促肿瘤炎症，增强抗肿瘤免疫。值得注意的是，对联合治疗有反应的NSCLC患者的血浆中CC10（club细胞分泌组成员）增加。通过揭示club细胞的免疫调节作用，本文的研究有可能指导ICIs在非小细胞肺癌中的未来临床试验。

 

尽管手术、放疗和分子靶向治疗取得了进展，但非小细胞肺癌的死亡率仍然很高。ICIs靶向程序性细胞死亡蛋白配体1（PD-L1）-程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）轴，通过激活细胞毒性T细胞活性促进肿瘤细胞杀伤。虽然这些抑制剂已被批准用于治疗晚期非小细胞肺癌，但由于肿瘤微环境（TME）中存在多种免疫抑制屏障，大多数患者的临床获益甚微。因此，迫切需要努力寻找能够克服这些障碍并提高ICIs疗效的免疫调节剂。RT具有潜在的免疫调节特性，因为它可以触发免疫原性细胞死亡并激活原发性肿瘤特异性T细胞的抗原提呈细胞，不仅限制原发性肿瘤生长，也能产生靶向远处（远侧）未经照射的转移病灶的全身效应。不幸的是，最佳的RT剂量和潜在的分子机制取决于癌症的类型，对于NSCLC，包括引起最佳免疫调节的测序和剂量/分割方案，很少有人阐明。

新研究支持ICIs与RT联合治疗包括NSCLC在内的各种肿瘤类型的治疗潜力。一项I期试验表明，先前接受放疗的NSCLC患者与未接受放疗的患者相比，ICIs治疗后生存期更长。然而，由于先前试验中缺乏确定的分子机制，目前的临床试验测试这种组合是由经验的选择，可能不是最佳的指导。近期，在Nature Cancer杂志上发表了一篇名为“Radiation-activated secretory proteins of  Scgb1a1+ club cells increase the efficacy of immune checkpoint blockade in lung cancer”的文章，提供了可能加速NSCLC中RT和ICI组合发展的机制性见解。

本文用突变型HKP1（KrasG12Dp53 −/−) 肺癌的正交异性小鼠模型，其在免疫活性C57/BL6小鼠中发展出组织病理学与人类NSCLC相似的腺癌。本文测试了先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的RT方案：8Gy（Gy）连续3天（8Gy×3）和两种较低剂量方案，4Gy×3和0.5Gy×3。值得注意的是，4Gy×3（4Gy RT）与PD-1抗体联合使用可显著控制肿瘤并提高生存率。结果表明4Gy RT可诱导有效的抗肿瘤免疫反应，从而增强HKP1模型中PD-1抑制的效果。图1：特定剂量的RT可增强HKPL NSCLC模型中PD-1抑制的效果。

为了阐明不同RT剂量的不同影响，本文在最后一次RT剂量后1d（RT开始后第4天）检查了T细胞浸润和细胞因子产生。在所有被检查的队列中，4Gy-RT显示最高肿瘤胰岛中浸润性CD8+T细胞的数量以及HKP1肺中干扰素（IFN）-γ+/肿瘤坏死因子（TNF）-α+/CD4+T细胞和GzmB+/CD8+T细胞的最高数量。这些4Gy-RT诱导的T细胞活性与其抑制PD-1的协同效应一致。在TME中4Gy RT不能重新激活预先存在的功能失调的T细胞，尽管T细胞反应增加，4Gy RT作为一种单一方式并不能显著控制肿瘤生长。进一步分析显示，4Gy RT增加了GzmB+/CD8+T细胞和IFN-γ+/TNF-α+/CD4+T细胞上的PD-1表达。假设PD-1检查点参与可能损害了4Gy RT诱导免疫反应的持久性。事实上，在随后的时间点（最后一次RT后的第7天）进行的分析表明，与第1天相比，T细胞浸润和细胞因子产生显著减少。添加抗4Gy-RT的PD-1抗体可显著增加GzmB的增殖+/与对照组相比，CD8+T细胞和IFN-γ+/TNF-α+/CD4+T细胞。此外，在联合治疗组中，在第7天观察到持续的T细胞浸润和效应细胞因子产生，但在单模式组中未观察到。总之，这些研究结果表明，4Gy RT与PD-1阻断相结合赋予持久的T细胞活性，可诱导持久的抗肿瘤免疫反应。图2 ：4GY-RT是否增加了携带Hkp1的肺中T细胞的浸润和激活

为了探索4Gy RT诱导抗肿瘤免疫应答的机制，本文对经RT（0Gy、4Gy或8Gy×3）联合IgG或PD-1抗体治疗的HKP1肺进行RNA-seq分析。差异表达基因在存在或不存在抗PD-1治疗的情况下，通过比较4Gy RT组、0Gy（模拟）组和8Gy RT（无效剂量）组来确定。通过将IgG队列中的4Gy RT上调基因与抗PD-1队列重叠，确定了144个由该有效辐射剂量特异性上调的基因。为了确定这些4Gy RT信号基因的细胞来源，对接受0Gy或4Gy-RT的HKP1承载肺进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析。通过将144个信号基因投影到t-SNE图，发现这些基因在气道上皮/club细胞簇中主要在4Gy RT后上调。大量RNA序列数据的基因集富集分析（GSEA）也显示，与0Gy和8Gy RT相比，4Gy RT治疗的小鼠气道上皮/club细胞特异性基因富集。这些发现表明4Gy RT可能激活肺驻留的club细胞。在4Gy RT标记基因中有许多特征明确的club细胞基因，包括Scgb1a1（CC10/子宫珠蛋白）和Scgb3a2（子宫珠蛋白相关蛋白1；UGRP1）、Hp（结合珠蛋白）、Cyp2f2（细胞色素P450 2F2）和编码表面活性剂相关蛋白的基因（Sftpa1、Sftb和Sftpd）。对离散细胞群的逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析证实，通过对club细胞进行4Gy RT处理，Scgb1a1、Scgb3a2、Scgb1c1、Hp和Cyp2f2的表达特异性上调，但在免疫（CD45+）、基质（CD45+）中没有上调。流式细胞术分析显示，4Gy RT导致携带HKP1和未接种肿瘤的肺中club细胞的扩增和增殖（Ki67）增加。此外，显微镜分析证实，经4Gy RT治疗的肺细支气管上皮区的CC10+荧光强度增加，但8Gy RT治疗的肺细支气管上皮区的CC10+荧光强度没有增加。总之，这些结果表明4Gy RT选择性地激活了肺常驻club细胞。图3：用4GY-RT治疗可激活肺微环境中的club细胞。

Club细胞是排列在肺细支气管上的非结缔组织外分泌上皮细胞。它们通过增殖和修复受损的气道上皮细胞，保护细支气管上皮免受外来物质的侵害。假设4Gy-RT可能引起肺上皮的中度损伤，进而引起club细胞的保护反应。采用药理学和遗传学两种方法在RT前选择性地耗尽club细胞。无论采用何种耗竭方法，在HKP1荷瘤肺中，club细胞的缺失减弱了对4Gy RT的免疫反应，例如显著抑制了T细胞向肿瘤胰岛的浸润，并减少了效应细胞因子的产生（CD4+中的IFN-γ/TNF-α和CD8+T细胞中的GzmB）。值得注意的是，club细胞缺陷消除了联合治疗HKP1荷瘤小鼠的疗效。为了证实club细胞在NSCLC中的重要作用，采用了另一种原位NSCLC模型CMT-167。一致地，4Gy RT以club细胞依赖的方式显著提高了携带CMT-167小鼠PD-1阻断的疗效。这些发现表明RT激活的club细胞介导联合治疗的疗效。

与对照组相比，使用电子显微镜对club细胞进行的进一步表征显示，从4Gy RT处理的肺中分离的club细胞中分泌小泡的数量增加。推测RT后club细胞的分泌组可能在提高ICI疗效中发挥作用。为了解决这个问题，使用Scgb1a1CreERTM/Snap23flox/flox转基因小鼠阻止club细胞分泌蛋白释放到肺TME中。突触体相关蛋白23（SNAP23）是SNARE复合物的关键组成部分，该复合物介导细胞内囊泡与膜融合以调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠可使Snap23基因的条件性club细胞特异性缺失，而不会改变细支气管的完整性。对支气管肺泡灌洗液（BALF）的分析证实，与野生型对照组相比，4Gy RT处理的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的CC10（club细胞分泌组的一种成分）显著减少。与club细胞消融一致，SNAP23缺陷消除了HKP1肺中对4Gy RT的反应中的T细胞浸润和激活，值得注意的是，与对照组相比，联合治疗未能控制Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠中的HKP1肿瘤生长。这些结果表明，联合治疗的疗效依赖于RT增强club细胞的分泌功能。图4 ：club细胞有助于联合治疗的疗效。

Club细胞在维持肺内环境平衡中是不可或缺的，被认为是肺腺癌的起源细胞。据报道，club细胞分泌珠蛋白（CC10和UGRP1）和表面活性剂相关蛋白（SP-A和SP-D）在过敏、哮喘和COPD条件下具有抗炎和免疫调节功能；然而，club细胞在调节非小细胞肺癌ICIs免疫应答中的作用尚未阐明。为了深入了解club细胞的免疫调节活性及其对NSCLC联合治疗疗效的贡献，本文在存在或不存在club细胞的情况下用4Gy RT和PD-1抗体治疗HKP1小鼠。club细胞缺陷（DT处理）肺显示髓系与淋巴细胞比率增加。此外，club细胞缺陷肺中的髓样细胞显示炎症介质表达增加，如Il1b、Ptgs2和Tnf，据报道，这些炎症介质可抑制适应性抗肿瘤免疫。推测这些club细胞介导的TME改变可能影响T细胞效应器表型。使用基于图形的分类，将T细胞分成九个簇，并根据其特征基因确定每个簇的功能状态。观察到效应T细胞簇（C5）显示细胞因子、效应分子（IFN-γ和TNF）和T细胞活化标记物（Pdcd1和Ctla4）的表达增加。这些scRNA-seq结果表明RT激活的club细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制HKP1肿瘤中髓样细胞介导的炎症。BALF样本的ELISA显示，与0Gy对照组相比，4Gy RT显著降低HKP1 TME中IL-1β、PGE2和TNF-α的水平；然而，在缺乏club细胞（DT处理的Scgb1a1cre/iDTR）或其分泌组（Scgb1a1cre/Snap23fl/fl）的情况下，4Gy RT不能减少这些炎症因子。总之，这些发现表明RT激活的club细胞通过分泌组阻止HKP1肺部的促肿瘤炎症，从而增强适应性抗肿瘤免疫。图5：RT激活的club细胞通过分泌组阻止HKP1肺部的促肿瘤炎症。

目前，由于物种特异性辐射敏感性和靶体积差异等原因，缺乏将动物模型的RT剂量转换为人类的标准，反之亦然。然而，本文的研究表明，未来的人类NSCLC临床试验应考虑优化RT剂量，可以有效地介导肺居住club细胞的激活。目前，缺乏在不损害肺上皮完整性的情况下激活club细胞的药理学或遗传学方法。进一步的研究需要确定分泌因子的最佳组成，从而产生强大的治疗效果。值得注意的是，SBRT增加对新辅助SBRT+ICI治疗有反应的NSCLC患者CC10水平的发现表明，血浆中RT诱导的club细胞分泌因子可能具有作为SBRT/ICI治疗反应/无反应的非侵入性生物标记物的潜力。综上所述，本文的研究成果有可能为将来的临床试验提供信息，以最大限度地提高非小细胞肺癌放射免疫治疗组合的疗效，从而提高病理反应率和生存率。

教授介绍：

Vivek Mittal

Vivek Mittal是康奈尔大学教授，主攻心胸外科，专业为细胞与发育生物学，研究兴趣主要有癌症-乳腺癌，癌症-肺癌，癌症转移，联合治疗，EMT，免疫肿瘤串扰，免疫治疗，肿瘤微环境等。Vivek Mittal及其团队使用综合的临床前和临床研究来确定肿瘤重编程的免疫微环境对肺癌和乳腺癌的贡献。Vivek Mittal正在研究包括亚消融辐射和靶向T细胞功能障碍的药物，内质网应激作为有效免疫调节剂以增强免疫检查点抑制剂功效的方式。他们的目标是阐明联合治疗的机制见解，确定预测无应答者主要病理反应者的细胞和分子生物标志物，并确定开发新型免疫疗法的临床相关靶点。

参考文献：

Yi Ban, Geoffrey J. Markowitz, Vivek Mittal etal. Radiation-activated secretory proteins of  Scgb1a1+ club cellsincrease the efficacy of immune checkpoint blockade in lung cancer [J].Nature Cancer | VOL 2 | September 2021 | 919–931 |www.nature.com/natcancer