火山图——直观的特征差异可视化

火山图（Volcano plots）是散点图的一种，根据变化幅度（FC，Fold Change）和变化幅度的显著性（P value）进行绘制，其中标准化后的FC值作为横坐标，P值作为纵坐标，可直观的反应高变的数据点，常用于基因组学分析（转录组学、代谢组学等）。

一、基本概念

1、什么是FC值，为何要取以2为底的对数？

FC值全拼Fold Change value，直译为差异的倍数，在生物信息学的分析中主要用于表示基因间表达量的倍数关系。如gene1表达量为10，而gene2表达量为100，则gene2对gene1的FC即为10，由此可知FC值域为（0，+∞），如Fig. 1所示，以FC = 1为分界，绿色箭头表示表达量下调（Down-regulated），红色箭头表示表达量上调（Up-regulated），可见上调区间明显大于下调区间，当FC取浮点数时，特别是极小数时较难直观展示。反之，当倍数关系取值极大的时候还会面临上下标出界的问题。

Fig. 1 基因上下调一维展示
当取以2为底，FC的对数时，便可以解决上述问题。log[2]FC > 0时上调，log[2]FC < 0时下调。

2、为何要引入P值

P value（P值）在统计学中用于表示统计学关系的显著性，通常通过各种统计学检验获得，值域为（0，1），经校准后的P值即为Padj（P-adjected），P值和Padj值二者取其一即可。类似于方差分析，在提取有价值的基因数据点时，仅通过比较FC大小是片面且无统计学意义的，还需获得与FC值关联的P值（Padj）才可确定其关系是否显著性。同理，P值也存在类似于FC值的问题，需标准化处理，即取-log[10]P或-log[10]Padj。
通过log[2]FC值和-log[10]P的约束，即可将研究涉及的数据点放到同一个二维空间，其中离群的数据点就是我们需要关注的数据点。

二、示例

1、加载相关的包。

#绘图的包
library(ggplot2)
#标记的包
library(ggrepel)

ggrepel包是ggplot2的补充包，在此主要用于标记目标数据点。

2、数据准备

加载数据，此数据为python(v 3.9)生成的虚拟数据集，代码符后。在数据框中添加sig向量，用于标记上下调基因和不显著的基因，用于后续给数据点着色。

#读取数据,数据使用python随机生成，代码附后
vp_data <- read.csv("volcano_plot_data.csv",header=T)

#标记上下调的基因，并添加sig向量
#上调的基因
vp_data$sig[vp_data$Log2FC > 2 & vp_data$X_log10Padj > 1.5] <- "up"
#下调的基因
vp_data$sig[vp_data$Log2FC < -2 & vp_data$X_log10Padj > 1.5] <- "down"
#变化不显著的基因
vp_data$sig[vp_data$X_log10Padj <= 1.5 | 
              (vp_data$Log2FC <= 2 & 
                 vp_data$Log2FC >= -2)] <- "insig"

添加label向量，用于存放需关注的数据点的标签信息。

#为有价值的基因数据点添加lab
#设置筛选条件log[2]FC = 2或-2, -log[10]Padj = 1.5 
invLog10P_limit = 1.5
Log2FC_limit = 2
#abs(x)为取x绝对值
vp_data$label=ifelse(vp_data$X_log10Padj > invLog10P_limit & 
                    abs(vp_data$Log2FC) > Log2FC_limit, 
                  as.character(vp_data$Gene.name), '')

3、绘图部分

定义坐标轴。

vol_plot <- ggplot(vp_data,aes(Log2FC, X_log10Padj))

添加数据点，根据sig列调色。

vol_plot = vol_plot + geom_point(aes(color = sig)) 

自定义点的颜色。

vol_plot = vol_plot + scale_color_manual(values = c("green","grey","orange"))

添加title和坐标轴名称。

vol_plot = vol_plot + labs(title="volcanoplot1",
                           x="log2(FC)",
                           y="-log10(Padj)")

添加虚线标记区间。

#添加标记-log[10]Padj区间的虚线
vol_plot = vol_plot + geom_hline(yintercept = invLog10P_limit,
                                 linetype=2,
                                 colour = "grey50")
#添加标记log[2]FC区间的虚线
vol_plot = vol_plot + geom_vline(xintercept=c(Log2FC_limit, -Log2FC_limit),
                                 linetype=2, 
                                 colour = "grey50")

为数据点添加标签，出图(Fig. 2)。

vol_plot = vol_plot + geom_text_repel(aes(x = Log2FC, 
                                          y = X_log10Padj, 
                                          label=label),     #添加标签图层
                                      max.overlaps = 10000, #标签布局参数，越高标签重合越少，类似于igraph的kk布局
                                      size=3,               #字体
                                      box.padding=unit(0.5,'lines'),   #标记点边框周围的填充量
                                      point.padding=unit(0.1, 'lines'),#标记点周围的填充量 
                                      segment.color='grey50', #标记与点的连线颜色
                                      show.legend=FALSE)      #是否添加legend
vol_plot

由于是随机生成的虚拟数据，并不能真实反应实际研究中的数据分布，但绘图原理是一样的。

Fig. 2 虚拟数据生成的火山图

4、使用真实数据绘图

将同样的方法应用于实际数据。由于数据存在差异，将筛选条件中的-log[10]Padj改为8。代码如下。得Fig. 3。

#读取数据,数据使用python随机生成，代码附后
vp_data <- read.csv("volcano_plot_data2.csv",header=T)

#更改筛选上下调基因的条件
#上调的基因
vp_data$sig[vp_data$Log2FC > 3 & vp_data$X_log10Padj > 8] <- "up"
#下调的基因
vp_data$sig[vp_data$Log2FC < -3 & vp_data$X_log10Padj > 8] <- "down"
#变化不显著的基因
vp_data$sig[vp_data$X_log10Padj <= 8 | 
              (vp_data$Log2FC <= 3 & 
                 vp_data$Log2FC >= -3)] <- "insig"

#添加label向量，为有价值的基因数据点添加label
#更改筛选条件
invLog10P_limit = 8
Log2FC_limit = 3
vp_data$label=ifelse(vp_data$X_log10Padj > invLog10P_limit & 
                       abs(vp_data$Log2FC) > Log2FC_limit, 
                     as.character(vp_data$Gene.name), '')

#绘图部分
ggplot(vp_data,aes(Log2FC, X_log10Padj)) +    
  geom_point(aes(color = sig)) +
  scale_color_manual(values = c("green",
                                "grey",
                                "orange")) + 
  labs(title="volcanoplot2",                                
       x="log2(FC)", 
       y="-log10(Padj)") + 
  geom_hline(yintercept = invLog10P_limit,linetype=2, colour = "grey50")+        
  geom_vline(xintercept=c(Log2FC_limit, -Log2FC_limit),linetype=2, colour = "grey50")+ 
  geom_text_repel(aes(x = Log2FC,                   
                      y = X_log10Padj,          
                      label=label),                       
                  max.overlaps = 10000,                    
                  size=3,                                  
                  box.padding=unit(0.5,'lines'),           
                  point.padding=unit(0.1, 'lines'), 
                  segment.color='grey50',                   
                  show.legend=FALSE) 

Fig. 3 火山图

美化后得Fig. 4, 图中灰色部分即为不显著或者变化较小的基因数据点，绿色为下调的基因，橙色为上调的基因。

Fig. 4 美化后的火山图

Supplemental

用于生成虚拟数据的python代码。

#Importing randint function to make numbers randomly
from random import randint
#Importing randint function to make numbers randomly
from random import shuffle
#A modular needed to mathematical operations
import math
#A modular needed to write data into .csv file
import csv

#demo data
Gene = []
FCs = []
Log2FC = []
_Log10Padj = []

#log2FC
while (len(Log2FC) < 2000):
        FC = randint(50, 1000)* 0.001
        L2FC = math.log(FC, 2)
        Log2FC.append(L2FC)
while (len(Log2FC) < 4000):
        FC = randint(50, 1000)* 0.001 
        L2FC =  math.log(FC, 0.5)
        Log2FC.append(L2FC)
shuffle(Log2FC)
Log2FC.insert(0, 'Log2FC')

#-log10Padj
#Creating value spanning 0 to 1.5
while (len(_Log10Padj) < 3800):
        data_l10P = randint(0, 1500) * 0.001
        _Log10Padj.append(data_l10P)
#Creating value spanning 1.5 to 3
while (len(_Log10Padj) < 4000):
        data_l10P = randint(1500, 3000) * 0.001
        _Log10Padj.append(data_l10P)
shuffle(_Log10Padj)
_Log10Padj.insert(0, '_log10Padj')

#Gene name
term = "gene"
for time in range(1, 4001):
    gene_name = f"{term}{time}"
    Gene.append(gene_name)
Gene.insert(0, 'Gene name')

data_list = [Gene,
             Log2FC,
             _Log10Padj]

#List transpose
data_list = list(map(list, zip(*data_list)))

#Writed list into a file.csv
with open('volcano_plot_data.csv', 'w', newline='') as file:
    writer = csv.writer(file, delimiter=',')
    writer.writerows(data_list)

Ending!!!