一文看懂植物单细胞测序怎么做？

作者：椰子糖
审稿：童蒙
编辑：amethyst

随着单细胞测序技术的突破，单细胞测序的时代已然到来。2018年单细胞基因组学被science评为年度突破技术，2020年单细胞多组学技术被Nature Methods 评为2020年年度技术。
其中10xGenomics作为单细胞测序方向上的佼佼者，持续致力于单细胞测序技术和新应用的开发，推动这单细胞测序时代的快速发展。目前应用其技术已经发表了2200+的文章，国内达230+的文章，其中大多数集中在人和动物方面，近年来，其在植物方向上的应用也在逐步扩大，涉及的物种包括拟南芥、水稻，以及玉米，本文就带大家一起看一下2021年1月4日由美国冷泉港实验室发表的有关玉米穗单细胞的文章。

一、文章概览

作物生产力取决于分生组织的活动能力。分生组织发育成植物的组织，包括玉米穗的结构。全面了解植物的发育过程需要洞察细胞类型和发育区域的多样性以及它们所需的特定的基因网络。到目前为止，这些发育的过程主要是通过形态学和传统遗传学的知识来鉴定的，而传统遗传学又受限于遗传转录的冗余和多样性。

文章研究了12525个来自玉米穗发育的单个细胞的转录谱。由此产生的发育图谱提供了花序的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱。并通过mRNA原位杂交和荧光活化细胞分类（FACS）RNA序列验证了我们的结果，并通过预测遗传冗余、整合转录网络和鉴定与作物产量性状相关的候选基因，进一步展示了这些数据如何促进遗传研究。

文章概览如下：

二、背景介绍

植物植株是由多能干细胞及其后代发育的分生组织发育而来的。分生组织能够分化为不同的细胞类型和具有特定功能的结构。在玉米穗发育过程中，部分分生组织形成花序结构。

突变体研究已经确定了关键的细胞类型或结构特异性调控因子，通过突变不同的发育结构域来调整花序结构的发育（Vollbrecht &Schmidt，2009）。例如，KNOTTED1（KN1）编码的同源域转录因子对分生组织的建立和维持至关重要，并且在整个茎分生组织中表达（Jackson等人，1994）。通过对KN1的突变来研究其在分化过程中的作用。在进化或驯化过程中，许多关键的调控因子调控花序的结构的发育，这些调控因子的发现是因为基因突变体的存在而得以实现的，同时这些突变体阻碍了的细胞在某些特定方向上的发育。然而，这些理论都受到遗传转录冗余性和多样性的限制，因此需要一个特定细胞类型和结构分布的高分辨率表达图谱来进一步了解控制发育的基因网络。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。最近，10x Genomics scRNA-seq平台已被广泛用于鉴定拟南芥根中的细胞类型或结构域标记（Rich Griffinetal.，2020），但该技术在茎组织中的应用还受到限制。单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状态的研究，以得到更完善的基因表达的信息。

文章利用10xGenomics scRNA-seq技术优化了一个方案，生成了玉米穗花序发育的高分辨率转录组图谱，进一步构建了转录调控网络，并确立与玉米穗产量性状相关的候选基因。

三、结果

1、玉米穗发育过程的单细胞转录组图谱构建

植物的单细胞图谱构建的两大挑战，其中之一就是原生质体的制备，文章采用5-10mm阶段的玉米穗，这个阶段决定了整个穗的发育，包括分生组织的起始，维持和终止以及器官发育的规格等。作者优化了细胞壁消化的方法，考虑到 不同细胞组成的差异，消化时间使用的45min。然而在制备原生质体的过程中，通过过滤去除破碎细胞中的小碎片和细胞器，然后通过流式细胞仪进入10xGenomoics系统制备文库，然后利用Illumina平台测序，分析了来自三个独立重复的12525个单细胞，检测了28899个基因的表达， 与普通转录组的基因表达检测情况相当。使用MetaNeighbor进行细胞聚类，共将其聚成12个类别。

构建植物单细胞图谱的另一个重要挑战就是细胞类别的注释和鉴定。为了鉴定每个聚类的差异性，作者编制了一份已知或预测的花序发育标记基因的列表，这些基因的表达模式已经在以往的玉米或拟南芥相关研究中进行了证实，其中74个基因在玉米中都有突变表型，本次检测中检测出了73个基因的表达，并且每个基因在12个类别中1个或者多个中表达量丰富。例如为了鉴定分生组织细胞类型，使用KN1基因，其在整个分生组织以及正在发育的茎和管道组织中表达，但并不在表皮和侧器官中表达。正如预期，KN1在12个类别中的10个中高表达，其他特征基因的表达情况也在下图中可以展示。玉米穗分生组织的纵切面和横切面也分别展示在下图的G和H中，其也显示了与scRNA的细胞聚类情况一致。

2、通过mRNA原位杂交和FACS RNA-seq验证单细胞测序结果

下图A绘制每个聚类中top2的marker基因的表达情况，其中颜色表示表达量的Z_score值，圆点大小表示细胞表达的百分数。进一步作者对关键的marker基因进行mRNA的原位杂交，颜色深浅表示基因的表达量情况。Marker基因的在组织中的表达情况与scRNAseq的结果相一致。

3、单细胞测序预测有助于构建转录调控网络

通过基因敲除的方式可以来研究某个基因在转录调控网络中的作用。从2个月大的茎尖（左下图，比例尺=100 mm）和6个月大的没有穗或流苏的植株可以看出，CRISPR-Cas9在ZmVOZ基因中敲除4个突变的玉米植株未能过渡到开花。

转录因子（TF）的直接调控靶点在相同的细胞类型中共同表达，使用scRNA-seq数据来计算KN1与其公布的直接调控的靶点的共表达，发现与所有玉米基因的对照相比，其显著高于预期。KN1直接调控的转录靶点在单细胞表达水平上与KN1显著共表达，支持原来的假设。KN1在除了表皮和侧器官中表达量均较高，而通过scRNA的数据发现ZmHDZIV8在3，6这两个聚类中大量表达，同时侧器官中的Marker基因ZmYAB4在聚类3中表达，因此明确了两个细胞类别。为了验证，接下来作者整合了两个额外的ChIP-seq数据集，用于ZmHOMEODOMAIN亮氨酸拉链IV6（ZmHDZIV6）（Javelle 等人，2011年）和ZmMADS16（ZmM16）（Bartlett等人，2015年）在特定花器官中表达。对于每一个TF在 Chip-seq的生物学重复中均有显著重叠，作者确定了ZMMADZIV6和ZmM16的907个高置信度峰，并对这两个基因的motif进行进一步的研究。

mHDZIV6候选调控靶点ZmNIP1A（G）和ZmPROPEP1（J）在scRNA序列中与ZmHDZIV6高度共表达。

4、单细胞测序鉴定的基因与玉米穗部性状相关

玉米穗形态与产量性状相关。为了研究在单细胞转录组中鉴定的细胞聚类和标记基因是否与玉米产量的候选调控因子一致。通过GWAS的方法，比较分生组织、侧器官和微管组织的scRNA-seq的Marker基因与281个玉米穗部与产量相关的形态性状的GWAS的结果结合。利用scRNA-seq的Marker基因2kb内的单核苷酸多态性，作者发现meta cluster 3标记基因ZmYABBY9（ZmYAB9）在CW（穗轴重量上）显著。图A中展示了玉米的相关产量的性状。同时还发现两个显著的单核苷酸多态性（10%FDR）与穗直径（ED）相关。

四、总结

总之，scRNA-seq为玉米穗发育的研究做出了重要贡献。该图谱可为发育遗传学研究和育种提供基础，文章开发的原生质体的制备方法和分析的方法可应用于其他复杂地上部系统的研究。随着越来越多的植物scRNA-seq数据集的产生，一个跨物种（例如，玉米和拟南芥之间）或跨组织（例如，茎和根）在单细胞分辨率下的比较分析将告诉我们在进化过程中如何选择基因特征，以形成对增殖增产和农业生产至关重要的各种形态。

五、参考文献

1. Xu X , Crow M , Rice B R , et al. Single-cell RNA sequencing of developing maize ears facilitates functional analysis and trait candidate gene discovery[J]. 2021.
2. Javelle, Marie, Klein-Cosson, et al. Genome-Wide Characterization of the HD-ZIP IV Transcription Factor Family in Maize: Preferential Expression in the Epidermis.[J]. Plant Physiology, 2011.
3. Bartlett M E , Williams S K , Taylor Z , et al. The Maize PI/GLO Ortholog Zmm16/sterile tassel silky ear1 Interacts with the Zygomorphy and Sex Determination Pathways in Flower Development[J]. PLANT CELL, 2015, 2015,27(11)(-):3081-3098.
4. Jackson, D., Veit, B., and Hake, S. (1994). Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development 120, 405–413.
5. Vollbrecht, E.,and Schmidt, R.J. (2009). Development of the Inflorescences. In Handbook of Maize: Its Biology, J.L. Bennetzen and S.C. Hake, eds. (New York, NY: Springer), pp. 13–40.
6. Rich-Griffin, C., Stechemesser, A., Finch, J., Lucas, E., Ott, S., and Sch€ afer, P. (2020). Single-Cell Transcriptomics: A High-Resolution Avenue for Plant Functional Genomics. Trends Plant Sci. 25, 186–197.