好久不见，大家好，今天给大家分享一篇2021年4月30日，发表在Science Advances上的文章《Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing》，文章通讯作者就是Eric N. Olson大佬。
Eric N. Olson教授的研究方向为骨骼肌发育，以及心脏发育与心脏疾病，教授团队在相关领域发表了很多高水平文章。
在本篇文章发表之前，教授团队就已经陆续发表了很多篇用基因编辑工具解决DMD疾病问题的文章。其中，在2018年10月，团队就在《Science》上发表了《利用CRISPR基因编辑技术成功地恢复杜兴氏肌肉萎缩症狗模型中的抗肌萎缩蛋白表达》的文章。
本文章的研究背景及研究意义主要包括两大块，一个是具有很高的医学研究意义的DMD疾病，另外一个就是文章中用到的两个目前在基因编辑领域研究火热的编辑器，单碱基编辑和先导编辑。
一、关于DMD疾病
1、杜氏肌营养不良症（DMD）是由于编码肌营养不良（抗肌萎缩）蛋白的DMD基因突变所引起的X连锁隐性遗传性神经肌肉病。
2、这种疾病主要影响男孩。肌肉无力最早可从三岁开始，到了十几岁，患者通常会丧失行走能力，心脏和呼吸肌肉也会受到影响，最终导致过早死亡。DMD是世界上最常见的肌营养不良症，每3500-5000个活产男婴中就有1个发生DMD。
3、临床样本表明，DMD基因的外显子突变有热点区域，突变会集中在DMD基因的第45-55号外显子，单个或者多个外显子的缺失会破坏掉DMD基因的开放阅读框（ORF），然后在下游的外显子区域提前引入终止密码子，导致翻译提前终止，而产生无功能性的截断的DMD蛋白。
二、关于两种基因编辑工具ABEmax和Prime editing
文章中用到的两种基因编辑工具都是基因编辑领域的大佬David Liu团队开发的，主要涉及到以下两篇文章。其中，ABEmax是ABE编辑器的优化版本。
下面我们来简单了解下两种基因编辑器的工作原理：
当融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA时，腺嘌呤脱氨酶可结合到ssDNA上，将一定范围内的腺嘌呤(A)脱氨变成肌苷(I)，I在DNA水平会被当做G进行读码与复制，最终实现A•T碱基对至G•C碱基对的直接替换（上图）。
在pegRNA的引导下，nCas9 (H840A)切口酶切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3'末端PBS序列互补并结合，之后逆转录酶发挥功能，沿RT模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5'-和3'-flap结构，其中3'-flap的DNA链携带有目标突变，而5'-flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5'-flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑（上图）。
在了解了研究背景及两种编辑器的工作原理后，回到文章正文，本篇文章的研究有2个前提：
1、本篇文章是针对DMD基因的51号外显子缺失的研究（DMD患者中最常见的单外显子缺失突变之一）；
2、本文章中所用的小鼠和细胞模型都缺失了DMD基因第51号外显子。
DMD基因总共79个外显子，由于第51号外显子的缺失，导致下游的52号外显子上提前引入了终止密码子，而导致翻译的提前终止，后续的外显子都得不到翻译，最终导致DMD（抗肌萎缩蛋白）无法正常表达，从而引起疾病。
针对DMD基因第51号外显子缺失而引起的DMD基因不表达，作者制定了2种修复策略，一种是外显子的跳读，就是通过破坏50号或者52号外显子两端的剪接受体位点（SAS）或者剪接供体位点（SDS），使得产生外显子跳读，发生选择性剪接，修复后续外显子的翻译功能，从而使得DMD基因恢复表达。第二种是外显子的重构，就是利用基因编辑工具，直接在50号或者52号外显子区域内插入2个碱基或者删除1个碱基，然后使得DMD基因恢复表达。上述提到的恢复DMD基因的表达，表达的蛋白其实也是截断的，不是完整的蛋白，但可以发挥DMD蛋白的功能。
在上敲除鼠实验前，作者首先在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞上进行了筛选实验，以筛选出最适的sgRNA。研究结果表明，使用sgRNA-4，在第50号外显子的SDS位点使得A到G的编辑效率是最高的。
筛选出最适的sgRNA后，就该上小鼠验证实验了，但在此之前还需要解决一个问题，就是编辑器的递送问题。因为AAVs能够递送的大小是在5kb以内，而作者要用到的编辑器的大小接近于6kb，所以作者就想到了将编辑器分开用AAVs包装再递送的思路。这里用到了一种反式剪接内含肽，可以将分开表达的编辑器给进行重组，而且不影响重组后蛋白的功效。这里多说一点，将编辑器分开包装并递送的技术也是大佬David Liu团队开发的，涉及到的文章在下图右下角，感兴趣的可以专门拿出来研究一下。
在解决完编辑器如何递送问题后，就该进行小鼠的验证实验了。
作者对出生第12天的敲除鼠注射编辑器（用AAVs分开包装的），并在三周后收集肌肉组织。然后，通过以下多种途径（RT-PCR，Sanger测序，WB，免疫组化，HE染色等）证明了在小鼠注射的胫骨前肌内确实发生了相应的编辑，并且在编辑发生后，恢复了DMD蛋白的表达。
因为DMD疾病的治疗是对人类疾病的治疗，所以作者又在人源细胞上进行了相关的实验。
下图是作者在293T细胞上进行了最适sgRNA的筛选，思路方法同前面在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞的筛选实验。
此后，在人心肌细胞（由人诱导型多能干细胞-iPSCs诱导分化而来）的验证，方法和思路同敲除鼠的验证实验一致（下图）。
最后，作者引入了Prime editing编辑器，我觉得作者的考量是用Prime editing编辑器弥补ABEmax系统在第52号外显子的SAS和SDS位点编辑能力的不足（因上述ABEmax编辑器在52号外显子的编辑效率过低），但作者在文章中利用Prime editing编辑器进行修复的部分，就没有前面做的那么详细了，在文章中也是简要的提到。
作者利用CRISPOR设计了13条sgRNA，并直接选用了评分最高的sgRNA-4，然后在人心肌细胞上进行了相关验证，验证方法和结果描述同上，这里不再赘述。
总得来讲，本篇文章发挥了作者团队的优势，就是对DMD疾病的研究，然后结合了目前研究火热的两种基因编辑工具，有很多可以供我们借鉴的思路，文章总体思路逻辑清晰，理解起来也不是很难，值得大家去学习研读。