error with fastqc and hisat2 in analysis

情景

想当年，小白强行按照他人的命令格式循环，致使重命名后翻车乱套。
因此，CC师兄教我批量循环，意思是不管id如何，都能使用。
一直以来，都是利用循环批量跑转录组数据。
这两天，同时跑两批次测序数据，一共9个样本。
结果，fastqc后只有17个文件。检查发现文件内容有点问题，开始以为是拷贝错误，检查不是这个问题，想着应该不是大问题就懒得修改。
接着，直接比对看，hisat2读不出来，与fastqc一样的报错。

问题及搜索答案

翻车啦~
看样子是个新问题，百度发现没有相同的问题。
bing一下关键词（If this is a FASTQ file with integer (non-ASCII-encoded) qualities, try re-running with the --integer-quals option），biostars有解答:Question: Error encountered using bowtie2 on Illumina fastq file。

记录一下

fastqc报错：

有个reads没有+，就不是fastq格式（自行百度）

Approx 5% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 10% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 15% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 20% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 25% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 30% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Approx 35% complete for L921-T23_good_2.fq.gz
Failed to process file L921-T23_good_2.fq.gz
uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.SequenceFormatException: Midline 'FFFFFTCCTTCTGCTGTTCFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFF,FFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:1555:7735:28948 2:N:0:CAACACAG' didn't start with '+'
    at uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.FastQFile.readNext(FastQFile.java:172)
    at uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.FastQFile.next(FastQFile.java:125)
    at uk.ac.babraham.FastQC.Analysis.AnalysisRunner.run(AnalysisRunner.java:76)
    at java.base/java.lang.Thread.run(Thread.java:844)

hisat2报错：

fastq文件中reads格式中有空格

Error: Encountered one or more spaces while parsing the quality string for read A00602:17:HC5JVDSXX:2:1555:32199:29011 2:N:0:CAACACAG.  If this is a FASTQ file with integer (non-ASCII-encoded) qualities, try re-running with the --integer-quals option.
terminate called after throwing an instance of 'int'
Aborted (core dumped)
(ERR): hisat2-align exited with value 134

解决方法

方法1：直接删去出问题的那个reads

方法2：可能是压缩解压过程中出现问题，查看一下_1.fq.gz和_2.fq.gz对应的行是什么。

解决尝试：

1.zgrep -A 4 "HC5JVDSXX:2:1555:32199:29011" L921-T23_good_2.fq.gz

-A 数字N 找到所有的匹配行，并显示匹配行后N行
,代表ASCII44，好像也没什么问题

zgrep -A 4 "HC5JVDSXX:2:1555:32199:29011"  L921-T23_good_2.fq.gz
@A00602:17:HC5JVDSXX:2:1555:32199:29011 2:N:0:CAACACAG
AAACAACAAAGTAAAATACAAAAATAATACATCAAGACAATTATTATGAAATAACTGATAAAATATATAAAAGCTATAACAAGGAAAGAAAAAATACATAATCAGACAGAAGACAACTAATATAAAATTGTTATATAGATACAAAAATTA
+
,FF,FF:FFF,FFFFFFF,,,,FFFFFFFFF,FFF,,,FFFF,FF:FF,F,FF,F,,,,FFFFFFF,FFF,F,FFFF:F,FFFFF:F,FF:FF,FFFFF,,F,,FF,F,,,F,F,,FFFFF,FFFF:,FFFF:FF:F:F,,,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF::0:CAAC 2:N:0CAACAGGFFFFFFFFFFFFFFGGCCCTTG2:N:0:8FFFFFFFFF

2.计算1.fq.gz和2.fq.gz分别的reads数目，即是行数的问题
结果：很明显，样本大小的问题（找公司扯皮去）。
计算两个样本reads数目，出问题的样本1.fq.gz和2.fq.gz数目不匹配，所以问题解决。

pengzw@super-server:~/data/pzw$ echo "`zcat L921-T23_good_2.fq.gz| wc -l` / (4*1000000)" | bc -l

gzip: L921-T23_good_2.fq.gz: invalid compressed data--crc error

gzip: L921-T23_good_2.fq.gz: invalid compressed data--length error
11.63124425000000000000
pengzw@super-server:~/data/pzw$ echo "`zcat L921-T23_good_1.fq.gz| wc -l` / (4*1000000)" | bc -l
29.30547300000000000000
pengzw@super-server:~/data/pzw$ echo "`zcat L921-T24_good_1.fq.gz| wc -l` / (4*1000000)" | bc -l
27.08013500000000000000
pengzw@super-server:~/data/pzw$ echo "`zcat L921-T24_good_2.fq.gz| wc -l` / (4*1000000)" | bc -l
27.08013500000000000000

附录：fastq格式解读

fastq质量格式.png

参考来源

感谢万能的生信交流论坛biostars：
https://www.biostars.org/p/57590/
https://www.biostars.org/p/246887/