2022-10-25

Cancer Cell 丨 条形码揭示NE与非NE癌细胞空间演化特征

原创 珍奇 图灵基因 2022-10-25 16:04 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：珍奇

IF：38.585

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

本研究利用EpicTags实现了条形码细胞的原位追踪；此外，EpicMIBI描述了克隆肿瘤斑块的空间、细胞类型和细胞状态；其中非神经内分泌细胞显示局部克隆性增长的增加；PTEN缺失可以促进非细胞自主的克隆性野生型细胞生长的增加。

肿瘤内异质性是人类肿瘤的一个重要特征，可促进肿瘤的发展。然而当前技术在很大程度上仍不适合准确追踪肿瘤内的表型和克隆演变，特别是对基因操作的反应。2022年10月13日，美国斯坦福大学Garry P. Nolan课题组于《Cancer Cell》杂志发表了一篇名为“Spatial epitope barcoding reveals clonal tumor patch behaviors”的研究型论文。该文章介绍了利用组合标记（EpicTag）开发的用于成像的表位，并将其与多重离子束成像（EpicMIBI）相结合，在组织微环境中对条形码进行原位追踪。使用EpicMIBI，他们剖析了小细胞肺癌异种移植模型中的细胞系和表型的空间成分。在这些模型中，混合克隆导致神经内分泌（NE）和非神经内分泌（non-NE）癌症细胞状态的克隆斑块的优先扩张，从而产生了新的特性。在部分PTEN缺陷癌细胞的肿瘤模型中，他们观察到PTEN野生型癌细胞的克隆斑块大小的非自主性增加。EpicMIBI促进了对参与瘤内异质性的细胞内外过程的原位研究。

为了利用表位编码区分细胞群，研究者设计了一种与C端GFP报告相连的EpicTag载体，该标签由表位组合组成。随后他们利用MIBI来区分细胞团切片中的条码细胞。生成的细胞团由50%的野生型NCI-H82细胞和50%的20个EpicTag标记的NCI-H82细胞系的集合群体组成。MIBI识别了细胞的GFP表达情况，并在GFP+的细胞中特异性地检测到表位的表达。对每个表位的信号进行分析后发现，所有20个条形码都是多色的图像。

为了进一步确定了EpicMIBI在体内研究的潜力，他们将20个条码细胞系集中起来在小鼠体内生成肿瘤。所有的表位组合再次通过质谱仪在离体肿瘤中检测到，并通过MIBI在肿瘤切片上检测到，这表明EpicTag表达在体内是持久的。随后他们通过混合mCherry+和GFP+癌细胞在小鼠体内产生肿瘤，并通过MIBI进行识别。多项实验都证明了EpicTag系统的模块化和可扩展性，它将表达良好的蛋白质与广泛的表位标记进行了多样化的组合。

越来越多的证据表明，NE细胞和非NE细胞之间的相互作用对小细胞肺癌（SCLC）的肿瘤生长和演变至关重要。因此，他们使用EpicMIBI调查了NCI-H82异种移植中肿瘤异质性的空间组织，特别是NE和非NE表型。通过使用一组抗体对NCI-H82肿瘤进行染色，他们确定了肿瘤微环境中的细胞条形码和各种细胞类型，以及癌细胞的功能状态。所有测试的抗体都产生了预期的细胞定位的可检测信号。NCI-H82细胞通过GFP表达被识别，并使用人类特异性线粒体标记物进一步确认。对于确定的每个NCI-H82细胞，他们还分析了条形码的表达，以及NE和非NE分化的标记（分别为突触蛋白和波形蛋白），表观遗传状态（H3K4me2、H3K27ac和H4K8ac-与活跃转录有关的组蛋白修饰），和代谢状态（分别为糖酵解和柠檬酸循环活动的GLUT1和柠檬酸合成酶标记）。

此外，他们还确定了增殖细胞（Ki-67和组蛋白H3的有丝分裂标志物phospho-Ser28，pS28 HH3）和DNA损伤的细胞（phospho-Ser139H2AX，γH2AX），以及小鼠内皮细胞（CD31）和基质细胞（α-平滑肌肌动蛋白[αSMA]）。综合分析结果表明，即使从一个成熟的癌细胞系中也能在体内产生复杂的空间重排。由此他们提出了疑问，即癌细胞的克隆性扩张是否会驱动这种结构的形成。

通过整合基于细胞和像素的解码方法，研究者进一步开发了克隆肿瘤地图，以表示条形码细胞的空间位置。他们推测，确定NCI-H82异种移植中每个癌细胞周围的细胞的祖先将对塑造肿瘤结构过程提供见解。因此他们使用该渠道确定了NCI-H82异种移植中的20个可能的表位组合，每个解编码的细胞系都表达了预期的表位，这表明基于表位的图像计算解构确定了肿瘤内癌细胞群的共同祖先。

每一个NCI-H82异种移植数据集中的细胞可提取出三个基本层次的信息：细胞所属的同源细胞系（EpicTag条码），其类型和状态（表型簇），以及表达的功能标记。空间部分提供了更深层次的信息，即每个细胞周围的细胞类型和状态（即CN），推断周围癌细胞的克隆性（即肿瘤斑块），以及标记物的亚细胞位置。分析结果表明，各集群和CN的条形码之间有良好的标记表达一致性。

PTEN是SCLC中肿瘤抑制因子，但SCLC肿瘤内PTEN突变体克隆的演变还未被充分研究。因此，他们在表达EpicTags 1和20的NCI-H82细胞中通过Cas9-sgRNA核糖核酸蛋白（RNP）传递敲除PTEN（PTEN-/-），并通过传递非靶向RNPs产生六个对照细胞系（EpicTags 2, 4, 14, 16, 17, 和18）。然后将这8个细胞系与剩余的12个野生型EpicTag编码的NCI-H82细胞系集合起来，产生一个由20个细胞系组成的群体（"PTEN-/-池"），并将20个原始EpicTag编码的细胞系作为对照。正如质谱结果所评估的那样，在PTEN-/-池中，EpicTag 1和20在培养中比其他系生长得更快，在实验结束时分别占群体的15%和29%。原先的（PTEN野生型）EpicTag 1和20没有竞争优势。这些观察结果验证了PTEN在SCLC细胞培养中的预期肿瘤抑制作用。

总之，PTEN在体外对NCI-H82和NJH29细胞系都是一种有效的肿瘤抑制因子，它的缺失导致NJH29的肿瘤生长有限地增加，但对NCI-H82异种移植没有生长优势。许多生物学观察结果在这两个SCLC模型中都得到了重现。EpicMIBI对NCI-H82和NJH29 PTEN基因敲除细胞的体内生长差异的机制提供了独特的见解：在PTEN-/-NCI-H82群体中，NE H3K27aclow细胞的比例较高，NCI-H82异种移植中NE H3K27aclow细胞有强烈的区隔，PTEN野生型细胞与PTEN-/-NCI-H82细胞混合的斑块大小增加。

通过在SCLC异种移植中应用条形码原位追踪的策略，作者表明基于条形码的多路复用与单细胞、深度原位组织表征相结合，可以揭示对肿瘤结构和进化的新见解。他们的数据显示，即使是成熟的细胞系也能形成复杂的肿瘤结构，其中一个或多个表型状态倾向于或产生附近的不同表型状态，具有相互依赖性。在这些结构中，他们确定了克隆斑块的局部生长，并检测了肿瘤内细胞表型的不同空间动态。通过将条形码的表达与特定的基因组编辑联系起来，他们进一步扩展了该系统的能力，为原位研究肿瘤生长过程中复杂的自主和非自主的细胞效应提供了新的机会。

教授介绍：

Garry Nolan，斯坦福大学医学院微生物学及免疫学教授。他的研究领域包括造血、癌症和白血病、自身免疫和炎症，以及网络和系统免疫学的计算方法。近期Nolan博士的工作重点是使用质谱-流式细胞仪混合设备进行单细胞分析，即所谓的 "CyTOF "和 "多参数离子束成像仪"（MIBI），该设备由Mike Angelo博士在其实验室所开发。这些方法使用先进的离子等离子体源来确定与细胞结合的标记试剂的水平，它们扩大了流式细胞仪（CyTOF）和癌症成像平台（MIBI）中每个细胞可测量的参数的数量。它们与另一个名为CODEX（Akoya, Inc.）成像平台的共同发展将有可能使荧光镜以廉价的方式转换为高维成像平台。

参考文献：

Rovira-Clavé X, Drainas AP, Jiang S, et al. Spatial epitope barcoding reveals clonal tumor patch behaviors [published online ahead of print, 2022 Oct 12]. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00443-3. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.014